劉虹，韓芳，石玉秀

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，沈陽110001）

創(chuàng)傷后應激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指突發(fā)的巨大災難（戰(zhàn)爭、地震等）或嚴重威脅的生活事件導致長期持續(xù)存在的精神障礙［1］。臨床表現(xiàn)為記憶異常、焦慮、恐懼增強等精神癥狀［2，3］。海馬是邊緣系統(tǒng)中學習、記憶的重要部位［4］，還是應激反應的調(diào)節(jié)中樞。我們前期的研究證實PTSD時杏仁核神經(jīng)元鈣超載［5］。海馬與杏仁核都屬于邊緣系統(tǒng)，而且相互聯(lián)系、相互影響。本實驗進一步研究PTSD時海馬神經(jīng)元Ca2+濃度的變化。內(nèi)質網(wǎng)是細胞加工蛋白質和貯存Ca2+的主要場所，對應激極為敏感。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）主要存在于內(nèi)質網(wǎng)，是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和協(xié)助蛋白質正確折疊的伴侶蛋白。檢測分子伴侶CRT在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的表達變化，探討CRT對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+信號的調(diào)節(jié)，為研究PTSD海馬記憶異常的發(fā)病機制提供依據(jù)。本研究采用國際公認的單一延長應激（single-prolonged stress，SPS）方法制備PTSD動物模型，用免疫組織化學、免疫印跡和逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測大鼠海馬神經(jīng)元分子伴侶CRT在PTSD內(nèi)質網(wǎng)應激的表達變化，用熒光探針標記法檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化，為揭示PTSD所致的記憶異常的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠（購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心），體質量150～180 g，12 h光亮/黑暗條件、溫度22～25℃，常規(guī)喂養(yǎng)，自由攝食飲水。隨機分為SPS1 d、4 d、7 d組及正常對照組，每組5只。

1.2 SPS模型的建立

采用國際公認PTSD動物模型制備方法［6］——SPS。SPS具體步驟：大鼠禁錮2 h后，強迫游泳20 min（水深 40 cm，水溫25℃），休息15 min后，乙醚麻醉至意識喪失。麻醉后將大鼠置于通風處至自然蘇醒，無干擾喂養(yǎng)，常規(guī)飲食直至取材。

1.3 光鏡標本制備

大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥麻醉后，4%多聚甲醛心臟灌流，取材，續(xù)固定3 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm。

1.4 CRT的免疫組織化學染色

切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，采用SABC法，各步驟間均用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。主要步驟：（1）0.3%TritonX-100室溫10 min；（2）3%H2O2室溫孵育10 min；（3）5%BSA 室溫20 min；（4）一抗 4 ℃過夜，兔多克隆抗體 CRT（英國Abcam 公司，1∶500）；（5）二抗及 SABC（SABC 試劑盒，武漢博士德公司）均37℃孵育20 min；（6）DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗數(shù)分鐘，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。免疫反應對照組用0.01 mol/L PBS代替一抗，其他步驟同上。光學顯微鏡（80i，日本Nikon公司）下觀察，攝片。

1.5 CRT的免疫印跡法檢測

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，加入裂解液，提取蛋白，考馬斯亮藍法定量后，SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉印，封閉，一抗兔多克隆抗體CRT（英國Abcam公司，1∶1000）和小鼠單克隆抗體GAPDH（北京中杉金橋，1∶1000）4℃過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（北京中杉金橋，1∶2000）室溫孵育1 h，ECL顯色。利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH的平均吸光度的比值表示相對表達水平，進行半定量分析。

1.6 CRT的RT-PCR檢測

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，利用Trizol試劑提取總RNA。分光光度計定量后，進行逆轉錄和PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術公司合成，CRT的引物序列：上游5′-CAAGGATATCC GGTGTAAGGA-3′，下 游5′-CATAGATATTCGCAT CGGGG-3′；β-actin 的引物序列：上游5′-GTCACCCA CACTGTGCCCATC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCG CTCAGGAG-3′。CRTPCR 擴增條件：94 ℃5 min，94℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán)，72 ℃10 min；β-actinPCR 擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，58℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)，72℃8 min。擴增結束后取5 μL擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進行觀察拍照并進行積分光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示相對表達水平，進行半定量分析。

1.7 海馬細胞游離Ca2+濃度測定

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，制備1×l06～1×107/mL的細胞懸液，經(jīng)臺盼藍排斥實驗檢查細胞成活率達95%以上后，加入2.5 μL預冷的Fura-2/AM（美國Sigma公司）37℃水浴箱避光孵育40 min；熒光分光光度計（F-4500，日本 HITACHI公司）檢測，發(fā)射波長為500 nm，激發(fā)波長為340 nm和380 nm。測定時依次記錄靜息、加入10%TritonX-100和0.3%EDTA后340 nm與380 nm的熒光比值，利用公式計算出細胞內(nèi)游離Ca2+含量，細胞內(nèi)游離Ca2+含量（nmol/L）=Kd（R-Rmin）F0/（Rmax-R）Fs。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 海馬神經(jīng)元CRT的免疫組織化學染色結果

CRT陽性表達主要位于胞質。正常對照組（圖1A）大鼠海馬陽性細胞少。SPS1d組CRT的表達增多（圖1B），SPS 7 d組表達最多（圖1C）。

2.2 海馬CRT的免疫印跡結果

CRT和GAPDH的分子量分別為64和36 kDa，條帶清晰（圖2A）。以GAPDH的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值進行校正和半定量分析。SPS1d、4 d、7 d組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2B），SPS 7 d 組海馬 CRT的表達最多。

2.3 海馬CRT的RT-PCR結果

PCR結果（圖3A）顯示，正常對照組大鼠海馬中CRTmRNA 均有一定的表達，SPS1d、4 d、7 d 組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學差異（P<0.05，圖3B），SPS 7 d組海馬CRT的表達最多。

2.4 海馬細胞內(nèi)游離Ca2+檢測

SPS1d、4 d、7 d組和正常對照組海馬細胞內(nèi)游離 Ca2+濃度分別為（390.335±9.917）、（360.138±9.411）、（336.304±7.413）和（301.534±5.725）nmol/L。SPS1d組大鼠海馬細胞內(nèi)游離Ca2+濃度增至頂峰，之后逐漸下降。

3 討論

PTSD是指由于災害、戰(zhàn)爭、交通意外等異常威脅性或災難性心理創(chuàng)傷導致出現(xiàn)長期持續(xù)性精神障礙，其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷為特征，并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡而言之，PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)［15，16］。海馬是負責學習和記憶的重要腦區(qū)，是調(diào)節(jié)應激反應并受應激影響的敏感區(qū)。內(nèi)質網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的細胞器，是調(diào)節(jié)蛋白質合成及合成后正確折疊的場所，也是調(diào)節(jié)細胞的應激反應及儲存Ca2+的場所。CRT是內(nèi)質網(wǎng)中主要的Ca2+結合蛋白，具有特殊的功能結構域［7，8］，由高度保守的N區(qū)、富含脯氨酸的P區(qū)和酸性的C區(qū)構成。其中C區(qū)具有高容量的Ca2+結合位點，有很強的與Ca2+結合的能力，參與內(nèi)質網(wǎng)中Ca2+的存儲，調(diào)節(jié)胞質內(nèi)Ca2+平衡，從而在機體鈣平衡中發(fā)揮重要作用。

本實驗研究結果表明PTSD海馬神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度增高，為減輕胞質 Ca2+超載［9］，CRT 表達上調(diào)。另外CRT作為分子伴侶參與處理未折疊蛋白反應［10］，減輕錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)腔的聚積。CRT的C末端存在內(nèi)質網(wǎng)滯留信號序列KDEL，確保滯留在內(nèi)質網(wǎng)中的錯誤折疊蛋白進行正確折疊，并轉運至高爾基體［11，12］。Molinari等［13］證實，CRT缺陷的細胞系其蛋白質折疊正確性大大降低。PTSD導致內(nèi)質網(wǎng)應激，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)聚集，激活未折疊蛋白反應。本實驗結果顯示，CRT表達上調(diào)，協(xié)助處理未折疊蛋白反應。過強的應激可使內(nèi)質網(wǎng)自穩(wěn)功能受損，誘導內(nèi)質網(wǎng)路徑細胞凋亡［17］。另外 Okunaga等［14］的研究表明CRT過表達改變Ca2+穩(wěn)態(tài)上調(diào)PP2A表達，抑制Akt信號轉導途徑，促進分化依賴性細胞凋亡。本研究揭示了分子伴侶CRT在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質網(wǎng)應激的調(diào)控作用。PTSD導致海馬神經(jīng)元內(nèi)質網(wǎng)應激、鈣超載、CRT表達上調(diào)，引發(fā)細胞凋亡，也為解釋PTSD學習和記憶功能異常的發(fā)病機制提供依據(jù)。

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