王淑民，武 峰，周 輝，郭韶潔，趙秀麗，李鵬飛，劉麗宏，耿玉先（. 首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構，北京 0070；. 第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 00088；. 北京萬生藥業(yè)有限責任公司，北京 0）

氯沙坦鉀是一種長效、高效、低毒的新型AT1拮抗劑，用于治療原發(fā)性高血壓。對大多數(shù)患者，通常起始和維持劑量為每天50 mg。其口服吸收后形成羧酸型活性代謝產物E-3174及其他無活性代謝產物。

氯沙坦及主要代謝產物E-3174的檢測最早有液相色譜紫外法及熒光法等[1]，但這些方法靈敏度低，需要血漿樣本量大，制備過程相對復雜，需要較長的分析時間。本試驗首次建立了采用甲醇直接沉淀方法處理血漿樣品，樣品無需濃縮，應用LC-MS/MS同時定量血漿中氯沙坦原型及其活性代謝產物E-3174，該方法比文獻[2-4]報道的方法前處理過程簡單，分析時間短，快速檢測，可成功地運用于氯沙坦鉀片的人體藥動學和生物等效性研究。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

試驗制劑：氯沙坦鉀膠囊（北京萬生藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格50 mg/粒，批號20090501）。參比制劑：氯沙坦鉀片（杭州默沙東制藥有限公司，規(guī)格50 mg/片，批號09427）。

氯沙坦鉀對照品（中國藥品生物制品檢定所，純度100%，批號100597-200501）。E-3174對照品（Philip Chan公司，純度98.7%，批號L470510）。替米沙坦對照品（廣州清平制藥有限公司，含量99.8%，批號M060601）。

甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，空白人血漿由解放軍二炮總醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗研究室提供。

3200 QTrap型液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理軟件（美國Applied Biosystems公司）；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵，自動進樣器，切換閥（美國Agilent公司）。

1.2 受試者選擇

本試驗共入選20名健康男性受試者，年齡27 ～35歲，平均（31±3.13）歲，身高161 ～ 180 cm，平均（170±6.16） cm，體重50 ～ 77 kg，平均（63.45±8.20）kg，體重指數(shù)19 ～ 24。20名受試者的年齡、身高、體重、血壓、心率、呼吸、體溫，實驗室檢查等各項指標測定值均在正常范圍內，心電圖及胸片檢查結果均正常。無伴隨疾病和藥物過敏史，精神狀況良好，無煙酒等不良嗜好，試驗前2周未服用任何藥物，試驗期間禁服其他藥物及煙、酒、茶等。受試者試驗前充分了解試驗目的、試驗內容及可能出現(xiàn)的不良反應，自愿簽署知情同意書。試驗經首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 給藥方案與血樣采集

按兩周期交叉自身對照試驗設計，20名健康成年男性受試者隨機分為2組，分別交叉口服試驗制劑或參比制劑50 mg，2次給藥間隔清洗期為1周。受試者于給藥前一天入住I期病房，隔夜禁食不禁水10 h以上，試驗于早晨8:00開始，按規(guī)定劑量口服試驗藥物。分別于服藥前，服藥后0.17、0.33、0.67、1、1.33、1.67、2、3、4、5、6、8、12、24、36 h于受試者上肢肘窩靜脈取血4 mL，血樣立即放置肝素化離心管，3500 r·min-1離心10 min，血漿置– 40 ℃冰箱保存待測。

1.4 分析條件

色譜條件：色譜柱：Kromasil C18柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-1 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）（78∶22）；流速：1.1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

質譜條件：離子源：離子噴霧離子化源正離子模式；離子噴射電壓：5500 V；溫度：580 ℃；源內氣體1（GS1，N2）壓力：48 psi；氣體2（GS2，N2）壓力：55 psi；氣簾氣體（N2）壓力：25 psi；掃描方式為多重反應監(jiān)測（MRM）；碰撞氣（N2）壓力：Medium；氯沙坦、E-3174、替米沙坦解簇電壓（DP）分別為：30 V、22 V、35 V；碰撞能量（CE）分別為：32 eV、32 eV、50 eV；氯沙坦、E-3174、替米沙坦用于定量分析的離子反應分別為m/z 423.4→206.9、m/z 437.4→207.4和 m/z 515.1→276.1，氯沙坦、E-3174用于定性考察的離子對分別為m/z 423.4→405.4、m/z 437.4→235.4。

1.5 血漿樣品處理

精密取血漿樣品100 μL置1.5 mL EP管中，加入甲醇溶液100 μL，加入內標溶液300 μL，渦旋30 s、離心5 min（13 200 r·min-1），取100 μL進行LC-MS/MS分析，進樣量20 μL。

1.6 專屬性實驗

專屬性實驗結果見圖1。

圖1 LC-MS/MS測定人血漿中氯沙坦、E-3174和內標替米沙坦的典型MRM色譜圖A – 空白血漿；B – 空白血漿中氯沙坦（3.0 ng·mL-1）、E-3174（3.0 ng·mL-1）、內標替米沙坦（5.0 ng·mL-1）；C – 受試者口服氯沙坦膠囊后1 h的血漿樣品；Ⅰ– 氯沙坦；Ⅱ– E-3174；Ⅲ– 替米沙坦（內標）Fig 1 Representive MRM chromatograms of losartan and E-3174 and temisartan (internal standard)A – blank plasma; B – blank plasma spiked with losartan and E-3174 and temisartan; C – 1 h plasma sample from one subject given a single dose of test losartan capsule; Ⅰ– losartan; Ⅱ– E-3174; Ⅲ –temisartan

1.7 標準曲線和定量限

取100 μL空白血漿，置1.5 mL EP管中，分別加入100 μL標準曲線溶液和300 μL內標溶液，渦旋30 s，離心5 min（13 200 r·min-1），進樣20 μL，進行LC-MS/MS分析。每個濃度3樣本，連續(xù)3 d，以血漿中待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，用加權（W = 1/x2）最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程。氯沙坦的回歸方程為：y = 0.024 8x+ 0.010 6（r = 0.994 5），E-3174的回歸方程為：y =0.004 91x + 0.014 3（r = 0.996 8）。氯沙坦和E-3174的定量下限均為3 μg·L-1。

1.8 精密度和回收率實驗

按“1.7”項下操作, 制備低、中、高3個濃度（氯沙坦和E-3174的濃度均為10.0、100.0、800.0 μg·L-1）的質量控制（QC）樣品，每濃度6樣本，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當日的工作曲線，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品結果計算本法的準確度與精密度。氯沙坦的低、中、高3個濃度的日內和日間變異系數(shù)分別是6.31%、7.33%、7.92%和17.04%、6.46%、11.67%；E-3174的低、中、高3個濃度的日內和日間變異系數(shù)分別是6.97%、6.29%、5.47%和11.89%、8.17%、10.38%。

1.9 提取回收率實驗和基質效應

取空白血漿100 μL，按“1.7”項下操作，制備低、中、高3個濃度的樣本（氯沙坦和E-3174的濃度均為10.0、100.0、800.0 μg·L-1），每濃度3樣本。同時另取空白血漿100 μL，加入甲醇（沉淀劑）100 μL，乙腈300 μL，渦旋30 s，離心5 min（13 200 r·min-1），上清液轉移至1.5 mL EP 管中45 ℃吹干，加入相應濃度的標準溶液100 μL，內標300 μL，渦旋30 s，取樣150 μL，進樣20 μL進行LC-MS/MS分析，獲得相應峰面積，以每一濃度兩種處理方法測得峰面積比值計算提取回收率，氯沙坦低、中、高3個濃度提取回收率分別為：（96.2±5.9）%、（93.6±5.6%）、（96.2%±5.7）%；E-3174低、中、高3個濃度提取回收率分別為：（96.4±6.0）%、（90.8±5.6）%、（98.4±5.6）%；內標替米沙坦的提取回收率為（94.3±5.2）%。以蒸餾水代替空白血漿，進行上述操作制作基質效應考察樣本。以每一濃度兩種處理方法測得濃度比值計算基質效應，氯沙坦和E-3174低、中、高3個濃度基質效應分別為1.56%和– 0.25%，內標基質效應為– 1.58%。結果顯示：血樣中氯沙坦、E-3174和替米沙坦的提取回收率均較高且穩(wěn)定，血樣中基質對氯沙坦、E-3174和替米沙坦的基質效應均較小（＜ 2%），不影響準確測定。

1.1 0 穩(wěn)定性實驗

配制氯沙坦和E-3174低、中、高3個濃度穩(wěn)定性QC樣品，每濃度3樣本，按“1.5”項下操作，測定濃度，進行冰凍放置40 d、3次冰凍融溶、室溫放置16 h穩(wěn)定性實驗。結果顯示，所有長期穩(wěn)定性實驗測定值與添加值的相對偏差（RE）均小于15%，表明冰凍放置血漿樣品、3次冰凍融溶、16 h室溫放置血漿樣品不影響本方法對樣品濃度進行準確測定。

1.1 1 統(tǒng)計學處理

采用DAS2.0軟件計算主要藥代動力學參數(shù)及進行生物等效性統(tǒng)計學分析，Cmax、tmax采用實測值，AUC采用梯形法計算。AUC及Cmax經對數(shù)轉換后進行方差分析、雙單側t檢驗及90%置信區(qū)間計算；tmax采用非參數(shù)法統(tǒng)計。

2 結果

2.1 血藥濃度-時間曲線

19名健康受試者交叉服用試驗制劑及參比制劑后，氯沙坦和E-3174的平均血藥濃度－時間曲線變化趨勢基本一致，具體見圖2、圖3。

圖2 受試者口服氯沙坦鉀試驗制劑和參比制劑后血漿中氯沙坦的平均藥時曲線. n = 19Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of losartan after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19

圖3 受試者口服氯沙坦鉀試驗制劑和參比制劑后血漿中E-3174的平均藥時曲線. n = 19Fig 3 Mean plasma concentration-time curve of E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19

2.2 藥代動力學參數(shù)及生物等效性

氯沙坦和E-3174的主要藥動學參數(shù)見表1，經統(tǒng)計分析，各參數(shù)在試驗和參比制劑間差異無顯著性（P ＞ 0.05）。氯沙坦和E-3174的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞經對數(shù)轉換后進行方差分析和雙單側t檢驗，2種制劑及給藥周期間差異均無顯著性（P ＞ 0.05）。90%置信區(qū)間的計算結果，Cmax分別為89.9% ～ 125.3%和94.1% ～114.7%，落在參比制劑的80% ～ 125%范圍內。AUC0-t分別為94.6% ～ 111.8%和99.7% ～ 109.5%，AUC0-t分別為93.5% ～ 110.0%和99.7% ～ 109.3%，均落在參比制劑的70% ～ 143%范圍內。參數(shù)Cmax、AUC0-t及AUC0-∞經對數(shù)轉換后進行方差分析和雙單側t檢驗，2種制劑及給藥周期間差異均無顯著性（P ＞ 0.05）。兩種制劑的tmax經非參數(shù)檢驗無顯著性（P ＞ 0.05）。因此，試驗制劑與參比制劑具有生物等效性。

表1 健康受試者單次口服氯沙坦鉀試驗制劑和參比制劑的主要藥動學參數(shù). n = 19, ±sTab 1 Main pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19, ±s

表1 健康受試者單次口服氯沙坦鉀試驗制劑和參比制劑的主要藥動學參數(shù). n = 19, ±sTab 1 Main pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19, ±s

E-3174試驗制劑 參比制劑 試驗制劑 參比制劑t1/2/h 1.84±0.52 1.99±0.60 4.17±0.49 4.13±0.66 tmax/h 0.70±0.22 0.98±0.62 3.14±0.72 3.39±0.96 Cmax/μg·L-1 183.8±91.30 176.45±93.97 344.85±114.33 329.95±106.42 AUC0-t/μg·h·L-1 333.18±105.00 323.75±101.92 2 445.09±608.97 2 332.54±564.72 AUC0-∞/μg·h·L-1 344.88±104.15 341.32±106.13 2 503.45±612.62 2 390.92±567.03 AUC0-t/AUC0-∞ 0.96±0.03 0.95±0.03 0.98±0.01 0.98±0.01參數(shù) 氯沙坦

2.3 安全性評價

通過受試者自發(fā)報告或由醫(yī)師觀察發(fā)現(xiàn)的不良事件，以及實驗室檢查異常，評價藥物的臨床安全性。同時，試驗期間以非誘導的方式詢問受試者可能有關的不良事件。共有19名受試者進入研究，在試驗期間，未發(fā)生嚴重不良事件。受試者均未出現(xiàn)有臨床意義的生命體征的改變和自訴不適及臨床癥狀。給藥后實驗室檢查發(fā)生異常，有5人次共6例，其中5例TG、1例TC升高，7 d后復查實驗室結果均恢復正常，經研究者判斷與試驗藥物的相關性為可能無關。研究者認為可能是一些受試者在試驗期間，活動減少，日常飲食改變等因素導致TG、TC一過性升高。

3 討論

氯沙坦是一種血管緊張素Ⅱ（AT1)受體拮抗藥，臨床上廣泛用于治療高血壓病和充血性心衰。體內體外研究表明，氯沙坦主要是由CYP2C9介導代謝轉化的。在7種代謝產物中，5-羥代謝產物E-3174具有比母藥更強的藥理活性，為氯沙坦藥物降壓作用主要來源。E-3174藥代動力學特性與母藥比較，t1/2更長和AUC更大[5]。研究結果表明，氯沙坦血漿濃度下降很快，8 h后幾乎降至檢測限以下。氯沙坦在體內約有14%轉化為E-3174,但是E-3174在血漿中的濃度和AUC遠遠高于氯沙坦，這是由于E-3174的清除率比氯沙坦的清除率低很多[6]。

LC-MS/MS檢測血漿樣品過程中，14號受試者在第Ⅱ周期，無法檢測到氯沙坦和E-3174濃度。經查詢原始記錄，14號受試者服用的是參比制劑，有該受試者給藥劑量及給藥時間記錄及所有血樣品采集記錄。因為參比制劑是市售制劑，并且只有1例受試者出現(xiàn)未檢測出血漿濃度，經研究者討論，認為很可能是該受試者自行未服藥，此受試者作為剔除病例。故入選了20例受試者，但19人參與了數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

呂承哲等[7]在其生物等效性文章中認為氯沙坦在體中的代謝有很強的個體特異性，CYP2C9*2和CYP2C9*3型突變會導致氯沙坦藥效降低，建議在臨床用藥過程中，具有CYP2C9*2 和CYP2C9*3等位基因的個體需加大氯沙坦用量或放棄選用氯沙坦降壓治療。在本研究中，氯沙坦在試驗制劑和參比制劑Cmax的CV%分別為49.7%和53.3%，E-3174分別為33.2%和32.3%。其中幾個受試者的Cmax低于其他人，這可能與基因多態(tài)性有關。