方建軍，祝華明，方芳，龔鴻萍，張旭，鄭睿行

（衢州市質量技術監(jiān)督檢測中心，浙江 衢州 324002）

硒是人體生命活動中必需的微量元素之一[1]，近年來受到人們的廣泛關注。它具有使人體抗衰老、預防癌變、保護與修復營養(yǎng)細胞、解毒排毒、提高免疫力等多種生理功能，被稱為主宰生命的元素之一[2-4]。硒對人體的重要性已十分明確，但權威資料表明硒的功能隨其形態(tài)不同而異，食物中無機硒的存在對人體是有害的，無機形態(tài)的硒特別是六價硒毒性很大，對人體毫無營養(yǎng)可言。只有有機形態(tài)的硒，如硒蛋白、硒代氨基酸、硒多肽、硒多糖等，在機體內(nèi)才能轉變?yōu)樯砘钚晕镔|，為人體所吸收利用[5]。

據(jù)調查，世界上有40多個國家和地區(qū)缺硒，我國也有72%的缺硒或低硒地區(qū)，其中近1/3為嚴重缺硒地區(qū)，而缺硒導致克山病的重要因素[6]。植物具有不同程度地吸收、利用和轉化土壤環(huán)境中硒的能力，是自然界硒生態(tài)循環(huán)中的關鍵環(huán)節(jié)。生長在高硒土壤上的植物硒含量顯著高于缺硒或低硒土壤上的植物。據(jù)浙江省國土廳資料表明，衢州市龍游縣有富硒土壤資源208平方公里，該縣盛產(chǎn)富硒蓮子，富硒大米，富硒油菜等特色農(nóng)產(chǎn)品。

目前，國內(nèi)外有關富硒農(nóng)產(chǎn)品與食品的研究并不多見，對有益硒形態(tài)的檢測與分析更是涉及甚少，但是有關補硒的保健品不少，盲目宣傳效果，導致消費者難以識別產(chǎn)品優(yōu)劣。因此開展對富硒農(nóng)產(chǎn)品中有益硒形態(tài)分析技術研究十分必要，幫助人們合理明智的選擇健康的富硒產(chǎn)品，科學膳食，具有重要的現(xiàn)實意義。

本實驗運用現(xiàn)代生物學的原理和先進的光譜分析技術，研究了龍游縣富硒地帶的富硒大米中硒的賦存形態(tài)及分布規(guī)律，探索出為人體所能利用的有益硒的含量，為合理開發(fā)利用富硒大米，完善富硒大米標準提供了重要科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

富硒大米采自浙江省衢州市龍游縣志棠富硒地帶。

1.2 試驗試劑

硝酸、鹽酸、高氯酸均為優(yōu)級純，氫氧化鈉、無水乙醇、氯仿、正丁醇、氨水、硼氫化鈉為分析純，硒標準溶液。

1.3 試驗儀器

雙道原子熒光光度計（AFS-930）：北京吉天科學儀器有限公司；電熱板（DB-2A）：常州國華電器有限公司；粉碎機（FS10）：九陽股份有限公司；離心機（TGL-18M）：上海盧湘儀離心機有限公司；控溫搖床（THZC）：江蘇太包市實驗設備廠；超純水儀（AD－SR20）：杭州永潔達凈化科技有限公司。

1.4 儀器條件

負高壓：340 V；燈電流：100 mA；原子化溫度：800℃；爐高：8 mm；載氣流500 mL/min；屏蔽氣流速：1000 mL/min；測量方式：標準曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時間：1 s；讀數(shù)時間：10 s；加液時間：8 s；進樣體積：2 mL，進樣方式：自動進樣。

1.5 方法

1.5.1 硒標準曲線的配制

將硒標準溶液配制成 0、4、8、12、16、20μg/L 的濃度梯度，繪制標準曲線。

1.5.2 總硒含量測定及加標回收試驗

1.5.2.1 總硒含量測定

將大米在粉碎機中充分粉碎，然后稱取兩份0.30 g于 50mL三角瓶中，加 10mL 混合酸（HNO3∶HClO4=4∶1），冷消化過夜，次日于電熱板上加熱，并及時補加混合酸，當溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時，再繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5 mL 6 mol/L鹽酸，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，以完全將六價硒還原成四價硒。冷卻，轉移定容至50 mL容量瓶中，同時做空白試驗。吸取2 mL試樣消化液于10 mL比色管中，加濃鹽酸2 mL，加水定容至10 mL，混勻進行氫化物原子熒光法測定總硒含量[7]。

1.5.2.2 加標回收試驗

稱取大米干粉0.30g兩份，每份樣品中加入10μg/L的硒標準溶液6mL，使加入樣品的硒含量為200μg/kg，按1.5.2.1處理，進行加標回收試驗，并計算回收率。

1.5.3 有機硒含量測定

稱取經(jīng)過粉碎機充分粉碎的大米干粉1.00 g，加少量超純水后，在研砵中碾磨使細胞充分破裂，定量轉移至事先準備好的透析袋中，用超純水在燒杯中透析24 h，每6小時離心更換一次超純水，將透析后的樣品取出，在離心機中12000 r/min離心15 min，取沉淀。按照1.5.2中的方法測定硒含量，并分析有機硒占總硒的比例。

1.5.4 堿溶性蛋白質提取及其結合態(tài)硒含量測定[8-10]

稱取經(jīng)過粉碎機粉碎的大米干粉10.00g，于500mL三角瓶中，加0.05 mol/LNaOH溶液100 mL在搖床中振蕩提取2 h，將混合液以12000 r/min離心15 min，取上清液，加入0.1 mol/L HCl調節(jié)pH=5.5，以12000 r/min離心15 min得到蛋白質沉淀物，在真空干燥器中干燥。將得到的蛋白質提取物稱量后，按照1.5.2.1中的方法測定硒含量，并分析大米中堿溶性蛋白結合態(tài)的硒含量，及其占有機硒的比例。

1.5.5 多糖提取[11]及其結合態(tài)硒含量測定

稱取經(jīng)過粉碎機充分粉碎的大米干粉2.00 g，加入100 mL的0.5 mol/LNaOH溶液，水浴80℃加熱2 h提取多糖，12000 r/min離心15 min，除去殘渣，清液用氯仿∶正丁醇（24∶1）洗蛋白3次，加入無水乙醇至溶液最終乙醇濃度為80%，靜置24 h，收集沉淀，在真空干燥器中干燥。將得到的多糖提取物稱量后，按照1.5.2.1中的方法測定硒含量，并分析大米中多糖結合態(tài)的硒含量，及其占有機硒的比例。

1.5.6 RNA提取及其結合態(tài)硒含量測定[12]

取大米干粉10.00 g，加200 mL 0.025 mol/LNaOH溶液搖床振蕩45 min，用3 mol/L鹽酸中和至pH=7.0，攪拌10 min然后加熱至90℃保持10 min冷卻至10℃，在12000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液用6 mol/L的鹽酸調pH2.5，冷室靜置過夜，12000 r/min離心15 min，收集沉淀加1滴～2滴氨水，30 mL蒸餾水溶解沉淀，用氯仿∶正丁醇（24∶1）洗滌蛋白質3次，將得到的水相在烘箱中60℃烘干稱重，按照1.5.2.1中的方法測定硒含量，并分析大米中RNA結合態(tài)的硒含量，及其占有機硒的比例。

1.5.7 精密度試驗

精確稱取大米干粉樣品0.30 g，平行樣品共6個，處理方法同1.5.2.1，檢測總硒含量。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

通過方法1.5.1得到不同濃度硒標準溶液對應的熒光值結果如表1。

表1 不同濃度硒標準溶液對應的熒光值Table1 Fluorescence value of different concentration Selenium standard solution

2.2 堿溶性蛋白及多糖提取

通過方法1.5.4，1.5.5得到結果如圖1，圖2。

圖1 大米蛋白Fig.1 Rice protein

圖2 大米多糖Fig.2 Rice polysaccharide

按方法1.5.4，1.5.5及 1.5.6得到圖 1大米蛋白0.47 g，圖2大米多糖0.39 g，RNA0.41 g，取適量的蛋白，多糖及RNA，按方法1.5.2.1操作，分析其硒含量，分析報告中蛋白硒平均值為1918.947μg/kg，多糖硒平均值為 80.357μg/kg，RNA 硒平均值為 76.572μg/kg，并根據(jù)以下式子計算大米中對應結合形態(tài)的硒含量。

大米中蛋白結合態(tài)硒含量=蛋白質中硒含量×蛋白質的質量/大米的質量

大米中多糖結合態(tài)硒含量=多糖中硒含量×多糖的質量/大米的質量

大米中RNA結合態(tài)硒含量=RNA中硒含量×RNA的質量/大米的質量

2.3 總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量

對大米樣品的總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量進行檢測結果見表2。

表2 總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量Table2 Content of total,protein,polysaccharide and RNA selenium μg/kg

2.4 大米中有機硒的主要賦存形態(tài)及其比例特征

由表2得到餅圖結果見圖3，圖4。

圖3 有機硒和無機硒的比例Fig.3 Organic selenium and inorganic selenium ratio

圖4 不同硒形態(tài)占有機硒的比例Fig.4 Different selenium form of organic selenium ratio

由表2和圖3可知，大米中總硒含量為206.708μg/kg，有機硒含量為168.875μg/kg，有機硒占總硒的81.70%。由圖4可知，有機硒中硒最主要的賦存形態(tài)是堿溶性蛋白硒占53.40%，其次多糖硒占9.28%，RNA硒占1.86%，其它形態(tài)的有機硒占35.46%。

2.5 精密度試驗

通過方法1.5.7試驗結果如表3。

表3 精密度試驗Table 3 The accuracy test

通過方法1.5.7試驗結果如表3，6個平行樣品總硒檢測結果重現(xiàn)性良好，相對標準差為0.966%，表明該方法具有很好的精密度。

2.6 加標回收試驗

通過方法1.5.2.2做樣品加標回收試驗，結果如下表4。

表4 加標回收試驗Table 4 The addition standard recovery test

通過方法1.5.2.2做樣品加標回收試驗，結果如上表4回收率為103.12%，說明該方法準確度良好。

3 結論

富硒大米作為一種富含天然硒的特色農(nóng)產(chǎn)品，已逐步被廣大消費者所接受，本研究采用原子熒光光度法測定了富硒大米中硒含量，并分析了硒在大米中主要的賦存形態(tài)，實驗結果表明，富硒大米中的總硒含量為 206.708μg/kg，達到 60μg/kg～300μg/kg 的富硒標準，而硒主要以有機硒形態(tài)存在，占總硒含量的81.70%，有機硒中硒最主要的賦存形態(tài)是堿溶性蛋白硒占53.40%，其次多糖硒占9.28%，RNA硒占1.86%，其它形態(tài)的有機硒占35.46%。測量硒標準曲線的相關系數(shù)是r=0.9997，樣品中硒的加標回收率為103.12%，相對標準偏差（RSD）為0.966%，試驗數(shù)據(jù)表明，該方法準確度高，精密度好，回收率高，符合試驗要求。本研究認為，天然富硒大米中有機硒含量高，形態(tài)豐富，多能為人體吸收利用，因此合理開發(fā)利用富硒大米，對于正確引導消費，促進人體健康安全，發(fā)展富硒地帶特色農(nóng)業(yè)具有重大意義。

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