周燕芳，劉丹凡

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東 潮州 521041）

草魚(yú)，俗稱(chēng)鯇、油鯇、草鯇、白鯇、草根、混子、黑青魚(yú)等，屬淡水魚(yú)，棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域。性活潑，游泳迅速，常成群覓食，為典型的草食性魚(yú)類(lèi)，在干流或湖泊的深水處越冬。草魚(yú)因其肉細(xì)嫩、味鮮美、生長(zhǎng)迅速，飼料來(lái)源廣，產(chǎn)量大、單產(chǎn)高、價(jià)格適中以及質(zhì)量上乘，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一，也是市場(chǎng)的暢銷(xiāo)貨[1]。

草魚(yú)富含豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、硒等營(yíng)養(yǎng)元素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶水解（以下簡(jiǎn)稱(chēng)酶解）草魚(yú)，并對(duì)酶解的工藝條件進(jìn)行研究，目的是確定最佳的酶解工藝條件,以便獲得品質(zhì)較高的酶解液,為草魚(yú)功能食品開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

草魚(yú)：購(gòu)于潮州市橋東市場(chǎng)，為淡水養(yǎng)殖草魚(yú)。

木瓜蛋白酶（BR，酶活力9.35 kat/mg）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海儀器試驗(yàn)有限公司；JJ-2型組織搗碎機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；501超級(jí)恒溫槽：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；800型離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠；85-2恒溫磁力攪拌器：常州國(guó)華儀器有限公司；FA2004N電子天平：上海精科；數(shù)顯精密pH計(jì)：上海手術(shù)器械廠；微量凱氏定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

新鮮草魚(yú)→蒸熟→壓榨去脂肪→65℃烘干→搗碎→魚(yú)粉（備用）→稱(chēng)量→加水稀釋→調(diào)pH→加入一定量的酶攪勻→加溫酶解一段時(shí)間→滅酶（沸水中15 min）→冷卻至室溫→離心（15 min）→收集所有上清液定容至100 mL→取10 mL測(cè)定游離氨基態(tài)氮

1.2.2 測(cè)定方法

蛋白酶活力的測(cè)定[2]：福林酚法；氨基態(tài)氮的測(cè)定：雙指示劑甲醛滴定法[3]；總氮量的測(cè)定：微量凱氏定氮法[4]；水解度的測(cè)定[5]：水解度（DH）=水解產(chǎn)生游離氨基態(tài)氮量÷原料總氮量×100%；其中“水解產(chǎn)生游離氨基態(tài)氮量=水解后酶解液中的游離氨基氮-魚(yú)粉中的游離氨基氮”。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[6-7]

酶濃度、底物濃度、酶解時(shí)間、pH和水解溫度為影響蛋白質(zhì)酶解的主要因素。本試驗(yàn)先通過(guò)考察各單因素對(duì)木瓜蛋白酶水解草魚(yú)的水解效果影響，以水解度為衡量指標(biāo)，確定各單因素的最適宜酶解條件，再采用正交試驗(yàn)L9（34）綜合研究，確定木瓜蛋白酶水解草魚(yú)的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因子影響的研究[8-10]

影響酶促水解反應(yīng)的因素很多，諸如酶濃度、底物濃度、酶解時(shí)間、pH和水解溫度等。即使同一種酶在水解不同底物時(shí)，水解的條件也不盡相同，所以應(yīng)首先對(duì)酶水解條件進(jìn)行單因素分析。

2.1.1 酶用量對(duì)水解度的影響

分別用酶用量為魚(yú)粉質(zhì)量的0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，在底物濃度為2.00%，pH為7.0，水解溫度55℃，水解時(shí)間為4 h條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，研究酶濃度對(duì)水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶濃度對(duì)水解效果的影響圖Fig.1 Effect of density of protease on hydrolyzation

由圖1可知，隨著酶用量的不斷提高，草魚(yú)蛋白的水解度逐漸增加，但當(dāng)木瓜蛋白酶的濃度達(dá)到一定程度后，水解度隨著加酶量的變化趨勢(shì)有所緩慢。因此綜合考慮經(jīng)濟(jì)性等因素，酶的濃度不宜過(guò)高。所以，確定酶的使用量為魚(yú)粉質(zhì)量的1.5%左右。

2.1.2 底物濃度對(duì)水解度的影響

分別配制底物濃度為1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%的草魚(yú)漿液，調(diào)節(jié)其pH為7.0，酶用量為1.5%，55℃下酶解4 h后測(cè)定其水解度，找出最佳的底物濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍?，隨著底物濃度的增加，草魚(yú)的水解度有所下降，這主要是因?yàn)樵诘蜐舛葧r(shí)，溶質(zhì)流動(dòng)性好，但酶和底物的濃度較低，反應(yīng)進(jìn)行比較慢；在高濃度時(shí)，溶質(zhì)流動(dòng)性差，體系的有效水濃度降低，導(dǎo)致酶與底物的接觸不充分，限制了反應(yīng)的進(jìn)行。因此，綜合各個(gè)方面的因素，本實(shí)驗(yàn)選取底物濃度為2.50%進(jìn)行酶解反應(yīng)條件的研究。

圖2 底物濃度對(duì)水解效果的影響圖Fig.2 Effect of density of substretum on hydrolyzation

2.1.3 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定木瓜蛋白酶酶用量為1.5%，底物濃度為2.50%，pH為7.0，反應(yīng)溫度為55℃，分別在酶解時(shí)間為 1、2、3、4、5、6 h 條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，研究酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 水解時(shí)間對(duì)水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on hydrolyzation

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸提高，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間（4 h）后，水解度的增加變得緩慢，基本上趨于不變。因此，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，認(rèn)為酶解的最佳作用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，為4 h左右比較合適。

2.1.4 pH對(duì)水解度的影響

選定木瓜蛋白酶酶用量為1.5%，底物濃度為2.50%，反應(yīng)溫度55℃，水解時(shí)間為4 h的條件下，分別于 pH=6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 中進(jìn)行酶解反應(yīng)，確定最佳酶解pH，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH對(duì)酶解效果的影響圖Fig.4 Effect of pH on hydrolyzation

由圖4可看出體系初始pH對(duì)水解度有一定的影響，在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)，水解度隨著pH的增加而提高，當(dāng)pH大于7.0時(shí)水解度隨著pH的增加反而有所下降。這就說(shuō)明采用木瓜蛋白酶水解草魚(yú)時(shí),酶解液的最適pH為7.0。因此，本試驗(yàn)體系的起始pH固定在7.0。

2.1.5 溫度對(duì)水解度的影響

設(shè)定木瓜蛋白酶酶濃度為1.5%，底物濃度為2.50%，水解時(shí)間為4 h，pH=7.0的條件下，分別于25、35、45、55、65、75 ℃等不同溫度中進(jìn)行酶解，通過(guò)水解度的具體數(shù)值確定最佳反應(yīng)溫度，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)酶解效果的影響圖Fig.5 Effect of temperature on hydrolyzation

由圖5可見(jiàn)，在溫度為25℃～65℃范圍內(nèi)水解度隨著溫度的升高而增大，當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時(shí)，水解度最大。隨著溫度繼續(xù)升高，水解度反而有所下降。這主要是由于溫度對(duì)木瓜蛋白酶的影響，溫度太高會(huì)使酶滅活，而溫度過(guò)低則酶的活性不足，兩者都會(huì)導(dǎo)致水解度的降低，因此最佳的酶解溫度為65℃左右，這時(shí)酶的活性最高。

2.2 草魚(yú)最佳酶解工藝條件的確定

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，酶濃度、底物濃度、酶解時(shí)間、pH和水解溫度均對(duì)酶解效果有一定的影響。考慮到酶解過(guò)程是受以上各因素的綜合影響，為了確定酶解的最佳條件及過(guò)程中各因素影響的大小，選取了酶濃度、底物濃度、酶解時(shí)間和水解溫度4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平來(lái)進(jìn)行正交試驗(yàn)，其中體系的pH采用固定值7.0，按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，確定其最佳酶解條件。各因素及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 木瓜蛋白酶酶解草魚(yú)蛋白L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 1 Orthogonal test of hydrolyzing Aristichthys nobilis by protease

續(xù)表1木瓜蛋白酶酶解草魚(yú)蛋白L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Continue table 1 Orthogonal test of hydrolyzing Aristichthys nobilis by protease

從表1可知，各因素對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果影響的大小順序是：底物濃度>酶濃度>酶解溫度>酶解時(shí)間。通過(guò)K值可知，最佳的酶解條件為A3B3C2D1，即酶濃度2.0%，底物濃度3.0%，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度60℃，在此條件下木瓜蛋白酶酶解草魚(yú)蛋白的最大水解度為45.93%。

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶對(duì)草魚(yú)魚(yú)肉蛋白進(jìn)行水解，水解效果較好，可以獲得水解度較高的酶解液。通過(guò)對(duì)單因素的考察，再結(jié)合正交試驗(yàn)可以確定出木瓜蛋白酶水解草魚(yú)的最佳酶解條件是：酶濃度為2.0%，底物濃度為3.0%，酶解時(shí)間為4 h，pH為7.0，酶解溫度為60℃，在此條件下木瓜蛋白酶酶解草魚(yú)蛋白的游離氨基態(tài)氮含量為498.85 mg/L，水解度可達(dá)到45.93%。

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