魏海香，梁寶東

（濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155）

香菇是世界第二大食用菌，它含有的多糖是一種特殊的免疫調(diào)節(jié)劑，在激活T淋巴細胞中具有強烈的宿主介導(dǎo)性，能刺激抗體形成，增強人體免疫力，發(fā)揮抗癌作用[1]。這種作用越來越受到人們的重視。目前，香菇多糖的提取方法有很多種，比如水浸提取法、酶提取、堿提法等。這些方法在提取香菇多糖上都有積極的意義，但具有費時長、耗能高、提取效率較低等缺點，這都是亟待我們解決的問題。近年來，隨著新型的科學(xué)技術(shù)不斷投入到多種物質(zhì)的提取中，超聲波技術(shù)在植物生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)等提取中的應(yīng)用較多[2-4]。本試驗立足于當(dāng)前珍珠香菇多糖提取的實際情況，以提高產(chǎn)率，降低成本為目的，采用新型的科學(xué)技術(shù)超聲波法提取珍珠香菇多糖，并確定最佳的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

珍珠香菇：實驗基地采收，個體大小勻稱，質(zhì)量較好。

1.2 儀器、設(shè)備

JY92-2D超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SY2-4電熱恒溫水浴鍋：北京市醫(yī)療設(shè)備廠；KEO-JD 201微電腦電磁爐：康佳集團股份有限公司；TDL-60B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；722N可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京市用光明醫(yī)療儀器廠；Ro（NaF－40）-UF-4010 實驗用膜分離超濾裝置：上海亞東核級樹脂有限公司。

1.3 藥品與試劑

葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、無水氫氧化鈉、丙三醇均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 珍珠香菇多糖的提取工藝

干珍珠香菇→粉碎→水提取→離心→超濾→多糖提取液

1.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子天平準(zhǔn)確稱取0.5 g無水葡萄糖，待溶解后定容至500 mL，即1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、1、2、3、4、5、6、7、8 mL 分別加入到50 mL的容量瓶中，各加5 mL的DNS，沸水浴5 min，流水迅速冷卻，定容搖勻，空白調(diào)零。靜置20 min，在540 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of dextrose

1.4.3 珍珠香菇多糖的測定3，5-二硝基水楊酸法[5]。

1.4.4 珍珠香菇多糖的提取率

珍珠香菇多糖濃度/%=（OD樣品-0.024）/3.8883

珍珠香菇多糖提取率/%=[（珍珠香菇多糖濃度×N×V）/M]×100%

式中：OD樣品為樣品在540 nm的吸光度；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為原料干重，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠香菇多糖提取單因素試驗

2.1.1 不同料液比對珍珠香菇多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000g珍珠香菇粉末，分別加入10、15、20、25、30 mL 的蒸餾水，經(jīng)過料液比為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的不同處理，設(shè)定超聲提取時間 60 min、提取溫度60℃、超聲波功率160 W，處理后，用離心機將樣品以3500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液進行超濾，然后用3，5-二硝基水楊酸法測定提取液的珍珠香菇多糖提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對珍珠香菇多糖提取率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on extration ratio of pearl lentinan

由圖2可知，珍珠香菇多糖的得率隨著液料比的變化而改變。在一定范圍內(nèi)，隨著液料比的增大，測得的珍珠香菇多糖提取率不斷增大。吸光度越高，主要是因為溶劑與珍珠香菇粉末充分接觸，在相同時間內(nèi)水溶性珍珠香菇多糖溶出量增加，故提取率逐漸增大。當(dāng)液料比大于25∶1（mL/g）時，曲線反而有所降低，說明多糖溶解基本飽和。如果液料比過小，未充分溶出，從而使得率降低；如果液料比過大，消耗的能量和時間會更多，同時也會減小超聲波破碎細胞的能力，使細胞破碎程度下降，從而降低有效成分的得率[6]，因此液料比為 25∶1（mL/g）較適宜。

2.1.2 不同超聲時間對珍珠香菇多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g珍珠香菇粉末，加入25 mL蒸餾水，設(shè)定提取溫度60℃、超聲波功率160 W，經(jīng)過40 min～120 min不同時間的處理，3500 r/min離心10 min，取上清液，然后用3，5-二硝基水楊酸法測定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同提取時間對珍珠香菇菇多糖提取率率的影響見圖3。

圖3 超聲波時間對珍珠香菇多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extration ratio of pearl lentinan

由圖3可知，隨著時間的延長，珍珠香菇多糖提取率明顯增大，但是當(dāng)提取時間大于80 min時，珍珠香菇多糖提取率反而有所下降。隨著浸提過程的進行，珍珠香菇多糖逐漸溶入提取液，所以提取率會逐漸增加，但是如果提取時間過長，珍珠香菇多糖提取率會有所下降，這是因為超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖斷裂，從而損失增大而影響多糖的得率。因此，提取時間為80 min較適宜。

2.1.3 不同超聲功率對珍珠香菇多糖提取效果的影響

用天平準(zhǔn)確稱取1.0000 g珍珠香菇粉末，分別加入25mL蒸餾水，設(shè)定提取時間40min、提取溫度60℃、液料比 25∶1（mL/g），處理后，3500 r/min 離心 10 min，取其上清液，3，5-二硝基水楊酸法測定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同超聲波功率對珍珠香菇多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲波功率對珍珠香菇多糖提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on extration ratio of pearl lentinan

由圖4可知，超聲波功率設(shè)定在120 W～160 W之間時，功率逐漸增大，提取率也隨之加大，這是因為超聲波的機械剪切作用加強，粉末珍珠香菇細胞破壞更充分，有助于細胞多糖的溶出[7-8]；在160 W～200 W之間，隨著超聲波功率的增大，提取率逐漸下降，主要因為當(dāng)超聲功率大于160 W時，超聲作用進一步加速了提取液的流動，減少了物料在超聲場中的停留時間，破壁作用也就隨之減弱，同時超聲波也會破壞珍珠香菇多糖的結(jié)構(gòu)，從而影響提取率。因此較適宜的超聲波提取功率為160 W。

2.1.4 不同提取溫度對珍珠香菇多糖提取效果的影響

用天平準(zhǔn)確稱取1.000 g珍珠香菇粉末，分別加入25mL蒸餾水，設(shè)定超聲波功率160W、提取時間80min，經(jīng)過20℃～100℃不同溫度處理后，3500 r/min離心10 min，取上清液，然后用水楊酸法測定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同提取溫度對珍珠香菇多糖提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對珍珠香菇多糖提取率的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on extration ratio of pearl lentinan

從圖5可看出，隨著提取溫度升高,珍珠香菇多糖提取率快速增加，溫度升高到60℃以上，增長趨勢趨于緩慢，從60℃～100℃珍珠香菇多糖提取率變化不大，因此從多糖得率和能源耗費平衡考慮，確定最佳提取溫度為60℃。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交設(shè)計

由單因素試驗結(jié)果可知，提取時間、超聲波功率、提取溫度、液料比4個因素的較優(yōu)水平分別是：80 min、160 W、60 ℃和 25∶1（mL/g）。所以，在這些最優(yōu)值附近選取較優(yōu)水平，按L9（34）設(shè)計進行正交試驗見表1。

表1 因素水平表Table 1 Coding of factors and levels

2.2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。從表2的直觀分析可以看出，極值R反應(yīng)了4個因素對多糖提取率的影響：RB>RA>RC>RD，即：因素對多糖提取率的影響順序：超聲功率、超聲時間、提取溫度、料液比。得出該正交試驗的最佳組合為B2A2C2D2。即料水比為1∶25，超聲時間60 min，提取溫度為60℃，超聲功率160 W。

表2 工藝正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.3 工藝驗證試驗

為驗證上述的最佳工藝，按確定的最優(yōu)工藝條件進行實驗，提取并測定珍珠香菇多糖的含量，結(jié)果為7.71%，超過了正交試驗中的測定值，說明優(yōu)選的工藝是科學(xué)的。

3 討論

超聲波的強烈攪拌、振動、空化作用可以破壞細胞結(jié)構(gòu)，加速有效物質(zhì)的溶出[9]，超聲波具有“空化現(xiàn)象”、“機械振動”以及“熱效應(yīng)”等特性?！翱栈F(xiàn)象”可產(chǎn)生瞬間幾千帕壓力，使提取介質(zhì)中的微小氣泡壓縮、爆裂，破碎被提取原料的細胞壁，加速目標(biāo)提取物的溶出，“機械振動”和“熱效應(yīng)”進一步強化了溶出成分的擴散，整個過程在瞬間完成，從而提高了破碎速度，縮短了破碎時間，極大地提高提取效率[10-11]。超聲波萃取珍珠香菇多糖已經(jīng)顯示出其優(yōu)勢。本試驗以珍珠香菇多糖作為檢測指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計，確定了超聲波提取珍珠香菇多糖的最佳工藝：料液比為1∶25，超聲時間60 min，提取溫度60℃，超聲功率160 W，所得香菇多糖提取率為7.71%。

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