李繼睿，禹練英，楊孝輝，郭君

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 株洲 412004）

野菊花為菊科多年生草本植物野菊的頭狀花序，外形與菊花相似，野生于山坡草地、田邊路旁。以色黃無梗、完整、氣香、花未全開者為佳。野菊花中含有菊醇（chrysol）、菊酮（chrysanthenone）、α-蒎烯、樟腦、龍腦、樟烯等，尚含野菊花內(nèi)酯（yejunualactone）、野菊花素A（artoglasin-A）、刺槐甙（acaciin）、蒙花甙（linarin）、菊甙、木犀草素、蒙花苷（linarin）、綠原酸（chlorogenic acid）、香草酸（vanillic acid）等[1-3]。

綠原酸具有廣泛的生物活性，是一種有效的酚型抗氧化劑，可以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害。可以保護(hù)膠原蛋白不受活性氧等自由基的破壞并能有效防止紫外線對(duì)人體皮膚的傷害作用。綠原酸在防癌、抗癌、創(chuàng)傷的治愈、皮膚健康濕潤、潤滑關(guān)節(jié)、防止炎癥以及體內(nèi)血糖的平衡調(diào)控等方面都有一定的療效。對(duì)多種致病菌和病毒有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用。綠原酸有降血壓、抗病毒、抗菌、增高白血球、消炎、預(yù)防糖尿病、顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌等作用。因此，在食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4-11]。

綠原酸分子結(jié)構(gòu)中由于具有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚等不穩(wěn)定部分，提取過程中，通過水解和分子內(nèi)酯基遷移而容易發(fā)生異構(gòu)化。因此，可以利用乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑從植物中提取綠原酸，常用提取方法有醇溶法、水提醇沉、醇提鉛沉、石灰乳沉淀法、聚酰胺柱層析法及超臨界萃取法等[12-14]。但是由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，提取時(shí)不能高溫、強(qiáng)光及長時(shí)間加熱，因此采用超臨界流體萃取法提取是一種較為理想的方法[15-16]。

本文對(duì)超臨界流體萃取法提取野菊花中綠原酸的工藝進(jìn)行探討，并利用正交試驗(yàn)法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菊花：市售；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；綠原酸對(duì)照品：南京替斯艾么中藥研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1801型紫外可見分光光度計(jì)：北京儀器有限公司；超臨界流體萃取裝置：江蘇華安超臨界有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗(yàn)方案

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及天然產(chǎn)物的提取經(jīng)驗(yàn)，確定考察因素為萃取壓力A、萃取時(shí)間B、萃取溫度C。分別取3個(gè)水平進(jìn)行考察?？疾煲蛩丶八揭姳?，采用正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以綠原酸得率作為考察參數(shù)。

表1 超臨界萃取因素及水平Table 1 Factors and levels of supercritical extraction(SPE)

1.3.2 工藝流程

綜合考慮提取效果和經(jīng)濟(jì)效益，固定萃取次數(shù)為1次，按上述正交試驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將野菊花于烘箱中烘干3 h，再將干野菊花用粉碎機(jī)磨碎。稱取100 g野菊花粉，加20 mL蒸餾水作為浸提助劑，裝入萃取斧中萃取一定時(shí)間，分離得到粗提物。工藝流程：野菊花花蕾→烘干→細(xì)粉→超臨界流體萃取→過濾→綠原酸提取液。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠原酸含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取綠原酸對(duì)照品6.3 mg，置于50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液溶解，定容即得[11-12]。

2.1.2 測(cè)定波長的選擇

取對(duì)照品溶液5.00 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液，定容即得。以70%的乙醇溶液為參比液，于紫外分光光度計(jì)上在200 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，吸收曲線見圖1。

結(jié)果表明在331.0 nm處有最大吸收峰，故選擇331.0 nm作為綠原酸的測(cè)定波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 綠原酸對(duì)照品的吸收光譜曲線（ρ=12.6μg/mL）Fig.1 The absorption spectrum of chlorogenic acid standard

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液 0.00、2.50、5.00、7.50、10.00 mL于5個(gè)50 mL容量瓶，用70%的乙醇定容。于紫外可見分光光度計(jì)上在λ=331.0 nm處測(cè)定吸光度（A），所得數(shù)據(jù)見表2。

表2 綠原酸對(duì)照品的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of chlorogenic acid contrast product

以吸光度A為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R=0.9999。綠原酸對(duì)照品的工作曲線見圖2。

2.1.4 樣品的處理和測(cè)定

2.1.4.1 野菊花的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取干燥野菊花樣品1.0 g，置回流提取裝置中，加入70%的乙醇25 mL提取1 h，過濾，殘?jiān)瑯臃椒ɑ亓魈崛?.5 h，過濾，殘?jiān)謩e用10 mL 70%的乙醇洗滌2次，合并各溶液于100mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，搖勻備用。取樣品溶液1 mL于50 mL容量瓶中，以70%的乙醇定容，搖勻后于331.0nm處測(cè)定吸光度（A），根據(jù)工作曲線計(jì)算出綠原酸的含量，所得數(shù)據(jù)見表3。

2.1.4.2 提取液測(cè)定

取綠原酸提取液，以70%的乙醇作溶劑稀釋，過濾，將濾液以70%的乙醇定容至100 mL。取各試樣0.5 mL于50 mL的容量瓶中用70%的乙醇作溶劑定容，待測(cè)。根據(jù)綠原酸對(duì)照品的工作曲線，計(jì)算樣品中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 野菊花中綠原酸的含量Fig.3 The content of chlorogenic in wild chrysanthemum flower

2.2 萃取條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照表1設(shè)計(jì)的因素水平根據(jù)正交表L9（34）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of L9(33)level orthogonal test

由表4可知，超臨界CO2流體萃取法的最佳提取條件為A1B3C3，即在萃取壓力為25MPa、萃取溫度為50℃、萃取時(shí)間3h。在此條件下，綠原酸得率達(dá)到0.4883%。從極差分析知在所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案范圍內(nèi)，各因素對(duì)綠原酸提取的影響大小順序分別是萃取時(shí)間＞萃取溫度＞萃取壓力。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最佳工藝條件A1B3C3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，4次實(shí)驗(yàn)平均結(jié)果為綠原酸得率為0.512%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想，說明該工藝條件簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)，確定了超臨界CO2流體萃取法的最佳提取條件為：在萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50℃下萃取3 h。在此條件下，綠原酸得率達(dá)到0.4883%。

CO2在超臨界狀態(tài)下對(duì)有機(jī)物有特殊增加的溶解度，而低于臨界狀態(tài)下有機(jī)物基本不溶解的特性，將CO2流體不斷在萃取釜和分離釜間循環(huán)，從而有效地將需要分離提取的綠原酸分離出來。

超臨界CO2流體萃取法提取綠原酸尚未應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，其原因：（1）分離過程在高壓下進(jìn)行，設(shè)備一次性投資大；（2）萃取釜無法連續(xù)操作，造成裝置的時(shí)空產(chǎn)率比較低；（3）過程消耗不容忽視，超臨界CO2流體萃取技術(shù)的開發(fā)，應(yīng)充分考慮其經(jīng)濟(jì)性。

綠原酸活性強(qiáng)，清熱解毒功能顯著，是替代化學(xué)抗生素的植物藥提取物。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加快和世界對(duì)中藥提取物需求量的增大，產(chǎn)品有巨大的市場(chǎng)空間和創(chuàng)匯潛力，因此，開發(fā)利用綠原酸這種寶貴的植物資源具有重要的意義。

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