孫潔心，孫強，張永忠

（1.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 150025；2.東北農(nóng)業(yè)大學應用化學系，黑龍江 哈爾濱 150030；3.教育部大豆生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆在用于食用油加工中產(chǎn)生的副產(chǎn)品豆粕數(shù)量可觀，這些豆粕除少部分用于發(fā)酵醬油、生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白或分離蛋白外，絕大多數(shù)被用作飼料，造成了豆粕資源的極大浪費。而大豆中含有的微量生理活性物質(zhì)大豆異黃酮絕大部分留在豆粕中而未被利用。

很多調(diào)查研究報道以及動物試驗表明，大豆異黃酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預防和抑制白血病、骨質(zhì)疏松、結(jié)腸癌、肺癌、婦女更年期綜合癥等多種疾病的發(fā)生，尤其是對乳腺癌和前列腺癌有積極的預防和治療作用[1]。一般認為苷元（主要是genistein和daidzein）是大豆異黃酮的主要活性組分。97%～99%的大豆異黃酮以糖苷形式存在，苷元形式僅為1%～3%[2]。

研究發(fā)現(xiàn)少孢根霉發(fā)酵豆粕可以使豆粕中絕大部分大豆異黃酮糖苷在β-葡萄糖苷酶的作用下水解為大豆異黃酮苷元[3]，發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元不但可以使產(chǎn)量大大增加，而且還可以降低成本，更具有吸引力的是能直接生產(chǎn)苷元，適合工業(yè)化生產(chǎn)[4]。因此從發(fā)酵豆粕中分離提取大豆異黃酮對于豆粕資源的綜合利用和提高其附加值具有重要意義。本研究旨在通過單因素試驗對于發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮的提取條件進行優(yōu)化，以期找到最佳的工藝參數(shù)，為發(fā)酵法生產(chǎn)大豆異黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆豆粕：哈高科大豆食品有限責任公司。

1.2 菌種

少孢根霉（CCTCC AF 96004）由東北農(nóng)業(yè)大學生命學院微生物實驗室提供。

1.3 試劑

染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷標準品：sigma公司；乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 儀器

UV-7500型紫外—可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；AL104型電子天平：上海天平儀器廠；H.H.S 21-2R型電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；DH600A型恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮總含量

1.5.1.1 三波長的選擇[5]

用紫外可見分光光度計對異黃酮提取液、染料木苷標準品溶液及干擾物溶液（純化大豆異黃酮后的剩余液）在紫外區(qū)（190 nm～400 nm）進行掃描，采用作圖法確定三波長的組合。

1.5.1.2 標準曲線的制作

準確稱取染料木苷標準品1.0 mg溶解于95%乙醇中，并定容至 100 mL。分別取 3、6、9、12、15 mL 此溶液于25 mL容量瓶中定容至刻度。用UV-7500紫外可見分光光度計測定3個波長處的吸光度，計算△A。以染料木苷的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，用Excel軟件處理，得回歸標準曲線。

大豆異黃酮提取量/（μg/g）=提取液中大豆異黃酮總量（μg）/發(fā)酵所用豆粕量（g）

1.5.2 發(fā)酵豆粕的制備

少孢根霉發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元的發(fā)酵培養(yǎng)基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸。發(fā)酵條件是發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵溫度30℃。通過實驗得出此條件下黃豆苷元轉(zhuǎn)化率為90.95%，染料木黃酮轉(zhuǎn)化率為92.24%。

1.5.3 最佳提取條件的選擇

以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)5個可能影響提取效果的影響因素做單因素試驗，以確定各因素對發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮提取量的影響作用，優(yōu)化出最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 三波長的選擇

測定大豆異黃酮的3個波長確定為λ1=240 nm、λ2=260 nm、λ3=280 nm。按三波長計算公式：

2.2 標準曲線的制作

用UV-7500紫外可見分光光度計分別在240、260、280 nm處測定不同濃度標準溶液的吸光度A240、A260、A280，計算吸光度△A。以△A為縱坐標，染料木苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線如圖1所示。

2.3 最佳提取條件的確定

2.3.1 乙醇濃度的確定

接種少孢根霉于發(fā)酵培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇在常溫下、磁力攪拌條件下提取30 min，料液比200 g/L，提取2次，在4000 r/min離心并合并提取液，定容至50 mL，稀釋后過濾，采用三波長紫外分光光度法測定總含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，當乙醇濃度為60%時，大豆異黃酮提取總量最高，為2855.485μg/g。當乙醇濃度繼續(xù)升高時，提取量反而降低。因此選擇提取濃度為60%的乙醇。

2.3.2 料液比的確定

接種少孢根霉于發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵培養(yǎng) 24 h。分別用 60%乙醇液料比 3∶1，4∶1，5∶1，6∶1 常溫下、磁力攪拌的條件下提取 30 min，提取2次，在4000 r/min離心并合并提取液，定容至50 mL，稀釋后過濾，采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮總含量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著料液比的升高，大豆異黃酮的提取量逐漸增加。在液料比為4∶1之后，大豆異黃酮的提取量增加不再明顯。為了節(jié)約能源，采用液料比4∶1，即料液比200 g/L作為最佳提取料液比。

2.3.3 提取時間的確定

接種少孢根霉于發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，分別提取 30、60、120、180、240 min，在 4000 r/min 離心并合并提取液，定容至50 mL，稀釋后過濾，采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮總含量，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，在提取時間為60 min時，大豆異黃酮提取已較徹底，延長時間對于大豆異黃酮的提取總量影響不大。為了節(jié)省時間，采用60 min為最佳提取時間。

2.3.4 提取溫度的確定

接種少孢根霉于發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，分別在室溫，40、60、80 ℃下提取 60 min，在 4000 r/min離心并合并提取液，定容至50 mL，稀釋后過濾，采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮總含量，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，大豆異黃酮的提取總量反而降低。原因可能是高溫條件下異黃酮苷元被氧化，詳細原因有待進一步研究。因此選用室溫作為最佳提取條件。

2.3.5 提取次數(shù)的確定

接種少孢根霉于發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，在室溫條件下分別提取1、2、3次，提取時間60 min。在4000 r/min離心并合并提取液，定容至50 mL，稀釋后過濾，采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮總含量，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，提取次數(shù)對于大豆異黃酮提取量的影響不大。在提取次數(shù)為2時，提取已較完全。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗確定從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取大豆異黃酮的最佳提取條件是：60%乙醇，料液比200 g/L，室溫下提取60 min，提取2次。此條件下異黃酮提取總量為2855.485μg/g。微生物發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元及其提取分離的研究，對綜合利用豆粕資源、提高其附加值具有重要的意義。

[1]NaimM,Gestetner B,Zikah S.Soybean Isoflavones.Characterization,Determination and Antifungal Activity[J].J Agric Food Chem,1974,22:806-810

[2]Wang H J,Murphy P A.Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in lowa:effects if variety crop year and location[J].Journal of agricultural and food chemistry,1994,42:1674-1677

[3]蔣大海,田娟娟,白志明.固態(tài)發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元[J].食品科學,2008,29(4):163-166

[4]井樂剛,張永忠.微生物發(fā)酵制備大豆異黃酮的研究進展[J].微生物學通報,2003,30(2):86-88

[5]魏福華,張永忠,井樂剛,等.紫外分光光度法測定大豆中大豆異黃酮[J].理化檢驗:化學分冊,2004,42(6):461-463