高天舒，尹慧絲

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110032;2.遼寧大學(xué)醫(yī)院，沈陽 110031)

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)是臨床常見的內(nèi)分泌疾病，近年來有關(guān)甲減心肌損傷的報(bào)道不斷增加。甲減心臟損傷最早由Zondek于1918年報(bào)道，肌球蛋白由Kuhne于1859年首先報(bào)道，是心肌的主要收縮蛋白。心臟是受TH調(diào)節(jié)的重要靶器官之一，肌球蛋白作為影響心肌收縮的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其重鏈(MHC)基因(α-MHC、β-MHC的基因)是甲狀腺激素TH調(diào)節(jié)的重要靶基因。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥應(yīng)歸屬中醫(yī)學(xué)虛勞范疇。我們在臨床工作中也發(fā)現(xiàn)，甲減發(fā)病之初多存在脾氣虛，治療上運(yùn)用補(bǔ)中益氣法治療甲減取得了較好的療效。補(bǔ)中益氣湯具有調(diào)補(bǔ)脾胃、升陽舉陷之功能，全方中黃芪益氣為君，紅參、白術(shù)、甘草補(bǔ)氣健脾和中為臣，輔以陳皮、當(dāng)歸、升麻及柴胡使本方在臨床上取得了較好的療效。

我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣法可以明顯降低甲減大鼠血清CK、CK-MB水平，提高甲減鼠血清T3水平［1］，但對(duì)甲減心肌損傷的改善是否與調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈α和β基因表達(dá)有關(guān)未見報(bào)告。故本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究補(bǔ)中益氣法對(duì)甲減大鼠心肌 α-MHC和β-MHCmRNA表達(dá)的影響，對(duì)進(jìn)一步證實(shí)中藥對(duì)甲減致心肌損傷的修復(fù)作用及其作用機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 4周齡清潔級(jí)Wistar大鼠120只，體質(zhì)量90g～120g，雌雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2009-0004)。

1.1.2 動(dòng)物飲食 普通飼料:由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。低碘飼料:根據(jù)衛(wèi)生部地方病調(diào)查、中國醫(yī)科大學(xué)流行病學(xué)結(jié)果以及承德市地方病研究所提供的資料，采用全國重度缺碘地區(qū)河北省承德市隆化縣大兩間房村的玉米、谷子、黃豆，按73∶20∶7的比例，加入適量的添加劑(每100g飼料添加 CaCO30.5g，Na2HPO40.15g，MnSO450mg，維生素 B66mg，維生素 B120.05mg，泛酸鈣5.5mg，葉酸 0.1mg，CoCl24.95μg，寶力維他 20mg，酵母粉1g)，由沈陽市于洪區(qū)前民實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料加工廠制成低碘飼料，其碘含量為20 μg/kg。

1.1.3 試劑 大鼠血清 TT3、TT4放免試劑盒(北京賽博潤特科技發(fā)展中心提供)、血清TSH測定試劑盒(美國 Rapid Bio公司)、凍干人尿中碘成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(購自國家碘缺乏病參照實(shí)驗(yàn)室)、cDNA合成試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、Triozol Reagent(美國Invitrogen Life technologies公司)、4%多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、2.5%戊二醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、20%烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、PBS緩沖液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、高氯酸鈉(化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、左甲狀腺素鈉片(德國默克公司)。

1.1.4 儀器 小型臺(tái)式離心機(jī)(美國SIGMA，1-13)、高速冷凍離心機(jī) sigma 31k5C型(美國)、PCR擴(kuò)增儀(德國 Biometra)、紫外分光光度計(jì)(英國 UV-visible Spectrometer，UV300)、ABI 7500 擴(kuò)增儀、DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BIO-DAD 680 酶標(biāo)儀、FJ-2008 PS γ 記數(shù)儀、切片機(jī)(德國 Leica公司)、心電圖機(jī)(日本光電)、DS-671型電子秤(上海寺岡電子有限公司)、代謝籠(蘇州市實(shí)驗(yàn)試劑玻璃儀器廠)、灌胃器(沈陽市實(shí)驗(yàn)試劑玻璃儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備和處理因素 甲減動(dòng)物造模方法按照Kolaja法［2］制作，選用4周齡清潔級(jí)Wistar大鼠(90g～120g)，雌雄各半，每天飼以低碘飼料，同時(shí)喂含1%高氯酸鈉的雙蒸水19d，續(xù)喂雙蒸水2d，造模成功后將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分成3組，即模型對(duì)照組、L-T4組、補(bǔ)中益氣湯組，每組30只。

處理因素:正常對(duì)照組飼以普通飼料，每只鼠每天灌服4ml雙蒸水;模型對(duì)照組低碘飲食，每日灌服4ml雙蒸水;L-T4組低碘飲食，每天灌服 2ml含2.6μg/kg左甲狀腺素鈉片的混懸液(根據(jù)體重約1～2周增加2.6μg/kg)，并灌服等體積雙蒸水;補(bǔ)中益氣湯組低碘飲食，每天灌服 2ml含生藥量13.96g/kg的補(bǔ)中益氣湯(補(bǔ)中益氣湯:升麻、柴胡、陳皮、當(dāng)歸、白術(shù)、紅參、炙甘草、黃芪。按人的常規(guī)日處方劑量，按與人相同體表面積折算)，并灌服等體積的雙蒸水。動(dòng)物處死時(shí)間和數(shù)量:分別在給處理因素后的0、8周處死動(dòng)物，每組每次相應(yīng)處死12只動(dòng)物。

1.2.2 標(biāo)本采集 處死前1d將大鼠放入代謝籠中，留 24h空腹尿，吸取 3ml～5ml，放入 5ml eppendoff管中，－20℃冰柜中保存，用于尿碘測定。處死前稱體重，20%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3000r/min離心 10min，血清存入 1.5ml eppendoff管中，－20℃ 冰柜中保存待測 TT3、TT4、TSH。處死后迅速摘取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈心腔內(nèi)殘余血，濾紙吸凈后稱質(zhì)量，取左心室心肌組織 2塊，一塊放入 1.5ml eppendoff管中，滴入1mlTrizol試劑，－80℃保存，用于實(shí)時(shí)定量 PCR的檢測;一塊于4%的多聚甲醛中固定，用于光鏡標(biāo)本的制作。摘取甲狀腺，剝離殘余結(jié)締組織，置于4%的多聚甲醛中固定，用于光鏡標(biāo)本的制作。

1.2.3 甲狀腺功能測定 血清促甲狀腺激素(TSH)測定采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，美國 Rapid Bio試劑盒。血清總 T3(TT3)、總T4(TT4)采用放射免疫分析法(RIA法)。

1.2.4 甲狀腺形態(tài)學(xué)觀察 分離甲狀腺后，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚切片，進(jìn)行HE染色光鏡觀察。

1.2.5 尿碘測定 采用中華人民共和國衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)砷鈰分光光度法。

1.2.6 心電圖描記 各組隨機(jī)抽取6只大鼠，于處死前1d乙醚麻醉，針狀電極刺入大鼠上下肢內(nèi)側(cè)皮下，用心電圖機(jī)記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，走紙速度50mm/s，標(biāo)定電壓 1mV=10mm。

1.2.7 心臟的臟器指數(shù) 稱取大鼠體質(zhì)量和心臟質(zhì)量，計(jì)算心臟的臟器指數(shù)(臟器指數(shù)是指某臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，常以每100 g體質(zhì)量計(jì)算)。

1.2.8 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 迅速摘取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈心腔內(nèi)殘余血，取左心室心肌組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察。

1.2.9 心肌組織 α-MHC和 β-MHC mRNA的表達(dá) 心肌細(xì)胞總RNA的提取:于左心室取0.1g心肌組織，總RNA提取方法按照Triozol Reagent(美國Invitrogen Life technologies產(chǎn)品)試劑說明書進(jìn)行。采用紫外可見光分光光度計(jì)(英國 UV-visible Spectrometer，UV300)測定 260nm、280nm OD 值，并計(jì)算RNA的純度及含量。樣品－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)定量RT-PCR:①逆轉(zhuǎn)錄:應(yīng)用cDNA合成試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA。取2μL總 RNA作為 imoban，oligo-dT做引物，反應(yīng)體系為 20μL，反應(yīng)條件為 37℃15min，85℃ 5s;②實(shí)時(shí)定量 RT-PCR:α-MHC、β-MHC 和內(nèi)參照 β-actin基因擴(kuò)增的引物序列均由北京華大基因公司設(shè)計(jì)并合成;③PCR反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL，PCR Forward Primer(10μM)0.4μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL，ROX Reference Dye II0.4μL，cDNA 模板 2μL，dH2O6.8μL，總反應(yīng)體系為20μL。PCR循環(huán)條件為:95℃0.5min 1個(gè)循環(huán)，95℃5s，60℃ 34s40 個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃15s1個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，分析結(jié)果并計(jì)算，利用SDS7000軟件分析實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 目的基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 尿碘值用尿碘中位數(shù)表示，其余數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。2個(gè)樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，2個(gè)以上樣本均數(shù)比較用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)均輸入Excell工作表中，用 SPSS17.0軟件包做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 血清甲狀腺激素及TSH水平

表2 補(bǔ)中益氣法對(duì)甲減Wistar大鼠甲狀腺功能的影響(±s)

表2 補(bǔ)中益氣法對(duì)甲減Wistar大鼠甲狀腺功能的影響(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:★★P＜0.01，★★★P＜0.001;與模型對(duì)照組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與 L-T4組比較:●●P＜0.01

組 別 處理時(shí)間 例數(shù) 血清TT3(nmol/L)TT4(nmol/L)TSH(mIU/L)0d 8 1.36±0.46 68.10±8.55 0.18±0.09對(duì)照組 8周 8 1.66±0.26 72.64±23.98 0.88±0.20模型組 0d 8 0.53±0.34★★★ 17.99±1.37★★ 3.01±1.97★★對(duì)照組 8周 8 0.92±0.29★★★ 28.30±17.73★★★ 4.51±1.01★★★L(fēng)-T4組 0d 8 0.59±0.12★★★ 35.03±19.38★★★ 2.71±0.52★★★8周 8 2.16±0.26△△△ 87.32±6.55△△△ 1.56±0.08△△△補(bǔ) 中 0d 8 0.78±0.18★★★ 18.63±1.54★★★ 2.54±0.2★★益氣組 8周 8 1.72±0.45△△ 72.97±25.75△△△ 0.93±0.03正常組△△●●

2.2 甲狀腺形態(tài)學(xué)觀察

正常組大鼠甲狀腺濾泡大小一致，呈圓形或不規(guī)則形，濾泡上皮多為立方形，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)均勻(圖1);模型組甲狀腺濾泡萎縮，上皮細(xì)胞呈高柱狀增生，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)缺少甚至消失，小血管擴(kuò)張充血(圖2);治療8周后2組均有所改善，部分甲狀腺濾泡上皮逐漸變扁，補(bǔ)中益氣湯組與 L-T4組比較，甲狀腺濾泡略大，濾泡上皮呈低柱狀，腔內(nèi)膠質(zhì)較多，優(yōu)于 L-T4組(圖 3、圖 4)。

圖1 正常組8周時(shí)(HE染色×400)

圖2 模型組8周時(shí)(HE染色×400)

圖3 L-T4組8周時(shí)(HE染色×400)

圖4 補(bǔ)中益氣湯組8周時(shí)(HE染色×400)

2.3 尿碘結(jié)果

2.4 心電圖表現(xiàn)

表3顯示，模型組大鼠與正常組比較心率減慢，QRS波峰值電壓降低(P＜0.01)，提示心肌供血不足;治療后2組均有所改善，但2組之間比較無差異，大鼠心電圖見下圖(圖5～圖8)

表3 各組 MUI值(μg/L)

2.5 心臟指數(shù)

模型對(duì)照組大鼠心臟指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

正常組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無細(xì)胞腫脹(圖9);模型組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，部分胞漿溶解、消失，液化性壞死，胞漿染色淡且模糊，肌纖維斷裂，肌紋消失和間質(zhì)水腫(圖10);治療8周后各組均有所改善，補(bǔ)中益氣湯組優(yōu)于LT4組(圖 11、圖 12)。

表4 大鼠心電圖心率、QRS波峰值電壓(±s)

表4 大鼠心電圖心率、QRS波峰值電壓(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:★★P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:△△P＜0.01，△△△P ＜0.001

組別 處理時(shí)間(周)例數(shù)心率(次/min)QRS波峰值電壓(mV)8 6 339±35 0.46±0.03模 型 對(duì) 照 組 8 6 230±23★★ 0.25±0.03★★L(fēng) - T4 組 8 6 432±27△△ 0.53±0.18△△補(bǔ)中益氣湯組 8 6 476±9△△△ 0.58±0.09正常對(duì)照組△△△

表5 大鼠心臟指數(shù)(±s)

表5 大鼠心臟指數(shù)(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:★★P＜0.01

組別 處理時(shí)間(周)例數(shù) 心臟指數(shù)(g/100g)正常對(duì)照組88 0.34±0.03 0.33±0.06模 型 對(duì) 照 組 8 8 0.38±0.04★★L(fēng) - T4 組 8 8 0.35±0.04補(bǔ)中益氣湯組88

圖5 正常對(duì)照組心電圖

圖6 模型對(duì)照組心電圖

圖7 L-T4組心電圖

圖8 補(bǔ)中益氣湯組心電圖

圖9 正常組8周時(shí)(HE染色×400)

圖10 模型組8周時(shí)(HE染色×400)

圖11 L-T4組8周時(shí)(HE染色×400)

圖12 補(bǔ)中益氣湯組8周時(shí)(HE染色×400)

2.7 心肌組織α-MHC和β-MHC mRNA的表達(dá)

表6顯示，甲減時(shí)，心肌細(xì)胞 α-MHC mRNA表達(dá)下調(diào)，受TH負(fù)向調(diào)節(jié)的β-MHC mRNA表達(dá)量呈顯著上升。治療8周后，α-MHC mRNA表達(dá)增加，β-MHC mRNA表達(dá)量減少，補(bǔ)中益氣湯組均優(yōu)于LT4組。用2－ΔΔCT法來決定目的基因在各組表達(dá)的相對(duì)水平。

表6 α-MHC與β-MHCmRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

肌球蛋白是影響心肌收縮的主要結(jié)構(gòu)蛋白，正常情況下，肌球蛋白存在于心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是一個(gè)六聚體大分子，可分為2條重鏈(MHC)和4條輕鏈(MLC)。重鏈分為α型和β型2種，α鏈有很強(qiáng)的ATP酶活性，能使ATP轉(zhuǎn)化為ADP，引起心肌收縮，而β鏈的轉(zhuǎn)化能力較弱。TH能夠促進(jìn)α-MHC基因的表達(dá)，抑制β-MHC基因的表達(dá)，使編碼α鏈的mRNA增多，ATP轉(zhuǎn)化為ADP的能力增強(qiáng)，從而提高心肌的收縮力［3，4］。甲減時(shí)，TH 分泌減少，心肌細(xì)胞α-MHC mRNA表達(dá)下調(diào)，受TH負(fù)向調(diào)節(jié)的β-MHC mRNA表達(dá)量呈顯著上升。劉桂芝［5］等人的實(shí)驗(yàn)證明，大鼠長期碘缺乏會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的甲減，心肌細(xì)胞中受TH調(diào)節(jié)的靶基因α-MHC mRNA表達(dá)下調(diào)，而β-MHC mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，導(dǎo)致心肌收縮力顯著減弱而影響心臟的功能。

TH的生物學(xué)作用主要是 T3與結(jié)合到DNA基因調(diào)節(jié)部位的T3受體(T3R)及其與相關(guān)蛋白的相互作用，通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。T3R在胞漿合成后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與靶基因上的TRE(甲狀腺激素反應(yīng)元件)結(jié)合，而不是像其他類固醇激素受體那樣，以激素受體復(fù)合物的形式進(jìn)入細(xì)胞核。TRE常位于靶基因轉(zhuǎn)錄起始部的上游［6］。甲狀腺激素首先與心肌甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor，TR)結(jié)合，活化的受體再與甲狀腺激素調(diào)控基因上的甲狀腺激素反應(yīng)元件 (thyroid hormone response element，TRE)結(jié)合，啟動(dòng)甲狀腺激素調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。甲狀腺激素就是這樣通過TR來調(diào)控甲狀腺激素調(diào)控基因表達(dá)水平，從而發(fā)揮其正常生理調(diào)控功能，TR是甲狀腺激素發(fā)揮作用的重要橋梁［7］。

補(bǔ)中益氣湯為低碘含量的方劑，而非富碘方劑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在治療癭病的中藥中，海藻、昆布為碘含量豐富的中藥即富碘中藥，其中藥飲片碘含量分別為682.46μg/kg和 794.69μg/kg，而當(dāng)歸中藥飲片的碘含量僅為1.58μg/kg，當(dāng)歸湯劑的碘含量也僅為31.67g/L［8］。從大鼠 MUI的數(shù)值來看，各組大鼠碘的供給量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中是較恒定的，治療后補(bǔ)中益氣湯組大鼠的尿碘中位數(shù)并未明顯提高，可見補(bǔ)中益氣湯為低碘方劑，而非富碘方劑。

本實(shí)驗(yàn)中，8周后甲減大鼠的心肌有了不同程度的損傷，心肌細(xì)胞腫脹，部分胞漿溶解、消失，液化性壞死，胞漿染色淡且模糊，肌纖維斷裂，肌紋消失和間質(zhì)水腫，心肌 α-MHC的 mRNA表達(dá)下調(diào)，β-MHC的mRNA表達(dá)上升。與正常組比較，模型組大鼠α-MHC的mRNA表達(dá)下調(diào)0.89倍，L-T4組、補(bǔ)中益氣湯組分別上升1.77倍、2.32倍，補(bǔ)中益氣湯組上升明顯;模型組大鼠 β-MHC的 mRNA的表達(dá)上升5.66倍，L-T4組、補(bǔ)中益氣湯組分別下調(diào)至正常組的2.61倍、1.17倍，補(bǔ)中益氣湯組下調(diào)明顯。補(bǔ)中益氣法明顯提高甲減大鼠 TT3、TT4水平，與 L-T4療效相當(dāng)，在心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的恢復(fù)、調(diào)節(jié)心肌 α-MHC、β-MHCmRNA的表達(dá)上明顯優(yōu)于 L-T4，說明補(bǔ)中益氣法在甲減心肌損傷的修復(fù)中起重要作用，其作用機(jī)制與提高心肌α-MHCmRNA的表達(dá)、降低心肌β-MHCmRNA的表達(dá)密切相關(guān)，但是否與提高心肌TR的表達(dá)及受體后的作用有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

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