劉 聲，孫桂芝，雷 娜

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053;2.山西中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，太原 030024;3.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100120)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外研究表明［1，2］，機(jī)體的炎性微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，并與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)和輔助性 T細(xì)胞 17(T helper 17 cells，Th17)的表達(dá)與功能密切相關(guān)。在特定條件下，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞受炎性細(xì)胞因子的影響會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，調(diào)控Treg/Th17之間的平衡是逆轉(zhuǎn)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中炎性內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文將探討活血及益氣活血中藥代表蘇木、蘇木+黃芪對(duì) Lewis肺癌荷瘤小鼠脾Th17、Treg細(xì)胞平衡及其相互間轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄分子的干預(yù)作用，為中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

黃芪、蘇木浸膏由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑中心提供，并由中藥煎制機(jī)煎制成原液，生藥含量為70.7%;準(zhǔn)確量取原液，隔水加熱蒸發(fā)濃縮而制成中藥浸膏(含生藥 2.1g·ml－1，生產(chǎn)批號(hào)20071121)。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20g±2g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證號(hào) SCXK-11-00-0006)，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物室喂養(yǎng)。Lewis肺癌荷瘤鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供(許可證號(hào) SYXK(京)2011-0001)。

1.3 試劑

FITC anti-mouseCD4、PE anti-mouse CD25、PEcy5 anti-mouse Foxp3、PE anti-mouse IL-17、CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit、LD、MSColumns(Miltenyi Biotic)、RevertiAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，SYBR Green I Master Mix(Applied Biosystems)，引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成。

1.4 儀器

FACS Calibur Flow Cytometer System(BD)，SM800解剖顯微鏡(Nikon)，VarioMACS磁性細(xì)胞分選儀(Miltenyi)，ABI7500熒光定量 PCR儀(ABI)，DU-640型紫外分光光度計(jì)(Beckman)等。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

取傳代第12天Lewis肺癌荷瘤小鼠，剝離瘤組織，選取生長(zhǎng)良好的腫瘤組織制備肺癌細(xì)胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2ml(經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，約含活細(xì)胞1×106個(gè)/ml)。

2.2 分組及給藥

小鼠接種后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、蘇木組、蘇木+黃芪組，每組20只?？瞻讓?duì)照組正常進(jìn)食進(jìn)水;荷瘤對(duì)照組接種24h后開(kāi)始給予生理鹽水灌胃0.2ml/d;環(huán)磷酰胺組接種24h后給予腹腔一次性注射環(huán)磷酰胺，劑量60mg/kg;蘇木組接種24h后給予蘇木浸膏灌胃(1.67g生藥/(kg·d))，蘇木 +黃芪組接種24h后給予蘇木 +黃芪浸膏灌胃(1.67g生藥/(kg·d)+黃芪15g生藥/(kg·d))。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 各組小鼠肺轉(zhuǎn)移情況 接種后14d、21d處死每組小鼠各10只，取肺用生理鹽水沖洗，Bouin液固定，解剖顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)。肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)=［1－實(shí)驗(yàn)組平均肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)(個(gè))/對(duì)照組平均肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)(個(gè))］×100%。

2.3.2 流式細(xì)胞儀 檢測(cè)各組小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞百分比動(dòng)態(tài)變化 于接種后14d、21d取每組小鼠各10只，摘眼球放血，斷頸處死小鼠，酒精消毒皮膚，迅速取脾稱重研磨，200目濾網(wǎng)濾過(guò)包膜及脂肪組織等，加入2mLPBS，收集脾細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞，取約 1×106細(xì)胞重懸于100ulPBS中，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 PECy5-抗 CD4、APC-抗 CD25、PE-抗 IL-17染色，上機(jī)檢測(cè)脾 Th17細(xì)胞;FITC-抗 CD4、PE-抗 CD25、PEcy5-抗 Foxp3 染色，上機(jī)檢測(cè)脾Treg細(xì)胞。

2.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組小鼠CD4 淋巴細(xì)胞 Foxp3、RORγtmRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平 取5×105分選后CD4+、CD25+T淋巴細(xì)胞，提取 RNA。引物序列 Foxp3:上游 5'-CTGACCA AGGCTTCATCTGT-3'，下游 5'-AACTCTGGGAATGTGCTGTT-3';RORγt:上游 5'-GGCTCCCTGGATGAATAGAATG-3'，下游 5’-AGGCAGAGGCAGAAAATGTAAAG-3。PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min，95℃ 25sec，55℃ 25sec，72℃ 50sec，72℃ 5min，循環(huán)次數(shù)為40，設(shè)β-actin作為內(nèi)參照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移情況

第14天各組小鼠除荷瘤對(duì)照組外未見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。表1顯示，第21天各組肺轉(zhuǎn)移灶均少于荷瘤對(duì)照組，蘇木黃芪組、環(huán)磷酰胺組與荷瘤對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與蘇木黃芪組相比，僅環(huán)磷酰胺組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移灶情況(±s)

表1 各組荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移灶情況(±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05;與蘇木黃芪組比較:△P＜0.05

組別 例數(shù) 轉(zhuǎn)移率(%)肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù) 肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)荷 瘤 對(duì) 照 組 10 100.00 10.59 ±5.71△ —23.61蘇木黃芪組 10 68.55 7.26±2.56* 31.45蘇 木 組 10 90.27 9.56±5.21△ 9.73環(huán) 磷 酰 胺 組 10 76.39 8.09±5.07＊△

3.2 各組小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞百分比及比值動(dòng)態(tài)變化

表2、圖1顯示，除蘇木黃芪組外，各荷瘤組小鼠脾Th17與Treg細(xì)胞百分比隨時(shí)間遷移呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。第14天和第21天各組間 Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞兩兩比較，與荷瘤對(duì)照組相比，其余各組均有顯著差異(P＜0.05);與蘇木黃芪組相比，僅環(huán)磷酰胺組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。各組Th17/Treg比值亦隨時(shí)間遷移呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，除蘇木黃芪組與正常組比較均存在Th17/Treg比值的平衡失調(diào)。

表2 各組荷瘤小鼠脾Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞百分比及比值動(dòng)態(tài)變化(±s)

表2 各組荷瘤小鼠脾Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞百分比及比值動(dòng)態(tài)變化(±s)

注:與正常組比較:※P＜0.05;與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05;與蘇木黃芪組比較:△P＜0.05

天數(shù)(d)組 別 例數(shù) Thl7細(xì)胞 Treg細(xì)胞Th17/Treg 14d正 常 組10 0.59±0.051 5.17±0.10 0.114荷瘤對(duì)照組 10 0.99±0.13△ 9.44±0.91△ 0.105※蘇木黃芪組 10 0.78±0.10* 7.00±0.14* 0.111蘇 木 組 10 0.86±0.09△＊ 8.12±0.34＊△ 0.105※環(huán)磷酰胺組 100.79±0.07* 7.12±0.66* 0.111 21d 正 常 組 10 0.60±0.09 5.19±0.81 0.116荷瘤對(duì)照組 10 1.20±0.39△ 9.52±1.01△ 0.126※蘇木黃芪組 10 0.79±0.06* 6.42±0.34* 0.123蘇 木 組 10 1.10±0.06＊△ 8.20±0.79＊△ 0.134※環(huán)磷酰胺組 10 0.78±0.13* 6.05±0.18* 0.129※＊

3.3 各組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞 Foxp3、RORγtmRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平變化

表3、圖2、圖3顯示，各組小鼠脾 CD4+T淋巴細(xì)胞Foxp3、RORγtmRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平變化，除蘇木黃芪組外，各荷瘤組小鼠脾Th17與Treg細(xì)胞百分比隨時(shí)間遷移呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。第14天和第21天各組間Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞兩兩比較，與荷瘤對(duì)照組相比，其余各組均有顯著差異(P＜0.05);與蘇木黃芪組相比，僅環(huán)磷酰胺組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖1 荷瘤小鼠脾Thl7/Treg細(xì)胞百分比

圖2 14d T淋巴細(xì)胞 Foxp3、RORγtmRNA的表達(dá)

圖3 21d T淋巴細(xì)胞 Foxp3、RORγtmRNA的表達(dá)

表3 各組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞Foxp3、RORγtmRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平(±s)

表3 各組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞Foxp3、RORγtmRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平(±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05;與蘇木黃芪組比較:△P＜0.05

天數(shù)(d)組 別 例數(shù) Foxp3mRNA RORγtmRNA 14d正 常 組10 1.08±0.05 1.18±0.02荷瘤對(duì)照組 10 1.16±0.07△ 1.69±0.04△蘇木黃芪組 10 1.07±0.02* 1.41±0.06*蘇 木 組 10 1.11±0.04＊△ 1.52±0.08＊△環(huán)磷酰胺組 10 1.08±0.03* 1.40±0.01*21d 正 常 組 10 1.10±0.10 1.19±0.06荷瘤對(duì)照組 10 1.81±0.08△ 1.91±0.14△蘇木黃芪組 10 1.53±0.05* 1.28±0.07*蘇 木 組 10 1.86±0.02△ 1.69±0.08＊△環(huán)磷酰胺組 10 1.62±0.03* 1.19±0.80*

4 討論

介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)胞與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞都來(lái)源于初始T細(xì)胞，兩者的功能和分化過(guò)程相互對(duì)抗，在正常情況下兩者保持平衡，有利于機(jī)體的免疫穩(wěn)定狀態(tài)的維持［3，4］。但在腫瘤發(fā)展的早期，Th17細(xì)胞發(fā)揮促炎性作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但隨腫瘤的發(fā)展炎癥得不到緩解，異常分泌細(xì)胞因子就會(huì)發(fā)揮促腫瘤作用;而Treg細(xì)胞在正常情況下，發(fā)揮著維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要作用，但隨著腫瘤的進(jìn)展，表達(dá)水平會(huì)不斷提高，進(jìn)一步造成免疫耐受，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫功能;同時(shí)，Th17與Treg細(xì)胞之間受異常分泌的細(xì)胞因子的影響會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。因此，Treg/Th17之間的動(dòng)態(tài)失衡最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)展中免疫編輯的差異，產(chǎn)生免疫逃逸和腫瘤轉(zhuǎn)移［5，6］。

前期研究中［7］，我們已經(jīng)觀察了活血藥的代表藥物蘇木和益氣藥的代表藥物黃芪對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示，益氣藥配伍活血藥具有抑制某些單純活血藥促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的趨勢(shì);對(duì)其作用機(jī)制研究顯示，益氣活血藥與單純活血藥比較可以降低Treg細(xì)胞表達(dá)，抑制Treg細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子。結(jié)合近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外研究［4］我們認(rèn)為，Treg細(xì)胞及分泌的細(xì)胞因子與Th17細(xì)胞的表達(dá)與功能密切相關(guān)，因此Th17細(xì)胞可能是益氣活血藥與活血藥干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移作用差異機(jī)制中Treg之后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)控 Treg/Th17之間的平衡是逆轉(zhuǎn)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中炎性內(nèi)環(huán)境免疫逃逸的新策略。

本次實(shí)驗(yàn)從各組荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移灶情況看出，益氣活血藥(蘇木+黃芪)優(yōu)于單純活血藥(蘇木);除蘇木黃芪組外，各荷瘤組小鼠脾Th17與Treg細(xì)胞隨時(shí)間遷移呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且蘇木黃芪組較其余各組有顯著差異;Th17/Treg比值亦隨時(shí)間遷移呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，除蘇木黃芪組外與正常組比較均存在比值的平衡失調(diào)。另外，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子 RORγt及Foxp3呈現(xiàn)出與Th17和Treg細(xì)胞相應(yīng)的動(dòng)態(tài)改變，說(shuō)明益氣活血藥在抑制腫瘤免疫耐受的形成和抑制腫瘤發(fā)展過(guò)程中的免疫炎癥反應(yīng)優(yōu)于蘇木組;益氣活血藥雖在個(gè)別指標(biāo)上與環(huán)磷酰胺組無(wú)顯著差異，但總體分析仍優(yōu)于環(huán)磷酰胺組。綜上，各組藥物對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移均有一定的抑制作用，但益氣活血藥優(yōu)于單純活血藥和化療藥物。

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