黃漢超 黃 琳 吳永剛 黃雪君 杜鐵良

（廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510250）

本研究擬采用自擬六君丹參顆粒對(duì)合并有動(dòng)脈粥樣硬化的自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)心血管重塑的干預(yù)作用并推測(cè)可能的作用機(jī)制，試圖明晰健脾活血化痰法在治療高血壓合并動(dòng)脈粥樣硬化的價(jià)值和地位。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SHR8周齡SPF級(jí)雄性，購自北京維通利華公司，編號(hào)：SCXK（京）2002-0003，共 50 只，平均體質(zhì)量 203.62g。所有大鼠在廣東省第二中醫(yī)院中醫(yī)研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室許可證編號(hào)：SYXK（粵）2005-0059，飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物 六君丹參顆粒配方：陳皮、法半夏、黨參、茯苓、白術(shù)、甘草、丹參、檀香、水蛭、砂仁，劑量分別相當(dāng)于生藥6、10、10、10、10、3、10、3、3、3g。

1.3 儀器與試劑 無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀，澳大利亞powerlab8/30；飛鴿牌AnKeTDL-5-A款離心機(jī)；722光柵分光光度計(jì)；酶標(biāo)檢測(cè)儀，美國伯樂公司Bio-RAD680；Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑，批號(hào)20 100408；谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑，批號(hào)20 100408；尿素氮試劑，批號(hào)20 100408；肌酐試劑，批號(hào)20 100408；由南京建成生物制品有限公司提供?；|(zhì)金屬蛋白酶-2、9（MMP-2、9）試劑盒由上海滬尚生物科技有限公司提供，批號(hào)：20100925。

1.4 分組與給藥 50只SHR分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各25只，實(shí)驗(yàn)組大鼠予六君丹參顆粒灌胃，每日2次，每次5mL，對(duì)照組予等劑量蒸餾水灌胃，每日2次。兩組共計(jì)給藥12周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）血壓監(jiān)測(cè)：各組取8只大鼠，在麻醉狀態(tài)下，用37℃溫水對(duì)其尾巴進(jìn)行反復(fù)擦拭，使尾巴血管充分?jǐn)U張，其后接血壓探頭于尾巴上，根據(jù)相應(yīng)的操作指示進(jìn)行檢測(cè)，每次測(cè)3個(gè)讀數(shù)，取平均值。（2）血液指標(biāo)：大動(dòng)脈采血約5mL后行離心，取上層血清進(jìn)行相關(guān)的指標(biāo)檢測(cè)。（3）動(dòng)脈病理學(xué)切片檢查：處死8只大鼠，取胸主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗干凈后予35%甲醛溶液固定，每條動(dòng)脈取5個(gè)橫切面，選取標(biāo)準(zhǔn)橫切面的切片進(jìn)行光鏡觀察，檢測(cè)動(dòng)脈管壁病理變化及中膜厚度與血管半徑之比。（4）心肌電鏡檢查：取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈，在大鼠心尖部用無菌手術(shù)刀片橫切厚約1mm左右的薄片，用2.5%戊二醛固定液固定后進(jìn)行電鏡檢查。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血壓及體質(zhì)量比較 見表1。隨著大鼠周齡增加，兩組收縮壓有上升趨勢(shì)，并均于20周時(shí)達(dá)到最高值，各組間比較分析，第12周起實(shí)驗(yàn)組收縮壓較對(duì)照組收縮壓有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；至第20周，實(shí)驗(yàn)組收縮壓及舒張壓較對(duì)照組收縮壓明顯下降 （P＜0.05）。兩組大鼠體質(zhì)量均有增加，但組間及組內(nèi)比較無顯著差異。兩組大鼠在飼養(yǎng)、給藥期間均無一死亡。

表1 兩組血壓比較（mmHg，）

表1 兩組血壓比較（mmHg，）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組 別 n 收縮壓 舒張壓12周 16周 20周 12周 16周 20周實(shí)驗(yàn)組8 186.23±8.24 188.38±8.26186.72±9.82* 110.62±9.54 112.74±10.91 112.61±8.87*對(duì)照組8 187.16±9.89 194.16±7.66 208.51±4.89 109.53±11.14 110.87±12.82 109.38±11.03

2.2 不同時(shí)間段大鼠管腔面積（LA）與管壁面積（WA）及主動(dòng)脈中膜厚度與管壁半徑變化 見表2。和對(duì)照組相比，治療組的LA/WA有提高的趨勢(shì)，第20周時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。中膜厚度在治療第16周時(shí)即明顯縮?。≒＜0.05），并且隨著治療時(shí)間的延長，效果越顯著。

2.3 不同時(shí)間段大鼠血清MMP-2、MMP-9水平變化 見表3。兩組各時(shí)間段MMP-2、MMP-9水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩組LA與WA及主動(dòng)脈中膜厚度與管壁半徑比較（n=8，）

表2 兩組LA與WA及主動(dòng)脈中膜厚度與管壁半徑比較（n=8，）

與對(duì)照組同時(shí)段比較，△P＜0.05。

組 別 LA（mm2） WA（mm2） 中膜厚度（μm） 管腔半徑（mm）實(shí)驗(yàn)組12 周 2.31±0.74 0.89±0.53 118.36±10.22 0.62±0.01 16 周 2.62±0.62 0.82±0.25 116.62±11.52△ 0.86±0.04 20 周 3.02±0.54△ 0.74±0.16△ 115.62±9.53△ 1.02±0.02對(duì)照組12 周 2.23±0.89 0.91±0.45 116.42±11.12 0.61±0.06 16 周 2.56±0.92 1.01±0.63 120.64±9.21 0.83±0.04 20 周 2.71±0.62 1.17±0.38 122.61±8.53 0.92±0.02

表3 兩組各時(shí)段MMP-2、MMP-9水平檢測(cè)（ng/mL，）

表3 兩組各時(shí)段MMP-2、MMP-9水平檢測(cè)（ng/mL，）

組 別 n MMP-2 MMP-9 12周 16周 20周 12周 16周 20周實(shí)驗(yàn)組 8 34.52±9.81 44.39±5.99 57.62±10.13 28.12±7.88 34.91±10.52 41.63±8.47對(duì)照組 8 36.92±10.68 48.21±9.21 60.52±9.38 25.11±6.94 35.62±8.52 44.68±9.61

2.4 大鼠主動(dòng)脈病理切片及心肌電鏡圖比較 對(duì)照組病理切片提示中膜彈性纖維排列紊亂中膜膠原纖維增生；實(shí)驗(yàn)組中膜彈性纖維較前排列有序，膠原纖維增生較前大鼠明顯減輕，見圖1。實(shí)驗(yàn)組在治療前，心肌纖維排列疏松、分離，線粒體集聚，心肌線粒體空泡發(fā)，見圖2。實(shí)驗(yàn)組在用藥后，心肌纖維排列較治療前變得整齊，線粒體體大小一致，少許空泡發(fā)，見圖3。

圖1 大鼠主動(dòng)脈病理切片圖（HE染色，×100倍）

圖2 實(shí)驗(yàn)組用藥前心肌電鏡圖

圖3 實(shí)驗(yàn)組用藥后心肌電鏡圖

2.5 安全性指標(biāo)檢測(cè) 見表4。第12周查血進(jìn)行安全性指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 兩組安全性指標(biāo)檢測(cè)比較（）

表4 兩組安全性指標(biāo)檢測(cè)比較（）

尿素氮（μmol/L）治療組 8 19.32±10.16 30.21±4.68 37.81±11.85 18.82±4.52對(duì)照組 8 12.61±8.72 35.61±6.42 43.62±9.83 20.55±5.85組 別 n 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L）谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L）肌酐（μmol/L）

3 討 論

高血壓是臨床的常見病之一，該病常伴發(fā)的心、腦、腎等靶器官損害。近年來研究表明，靶器官的損害與心臟和血管重塑有密切關(guān)系，血管重塑將使血管阻力進(jìn)一步增加，管腔變窄，并繼而引起或加重靶器官的損害。因此對(duì)血管重塑的干預(yù)性研究已成為國際上高血壓研究的熱點(diǎn)之一。SHR為常用的動(dòng)物模型之一，與人類原發(fā)性高血壓形成機(jī)制有相似之處，對(duì)SHR的形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)證明：阻力血管的結(jié)構(gòu)性改變甚至在高血壓形成之前已經(jīng)出現(xiàn)，因此血管重塑可能貫穿高血壓發(fā)病的始終，是高血壓發(fā)病的主要機(jī)制之一，能有效逆轉(zhuǎn)血管重塑將有助于減緩高血壓的進(jìn)程［1］。中醫(yī)藥對(duì)高血壓心血管重塑的干預(yù)性研究尚不多，在已有的研究表明，在動(dòng)脈硬化的形成、發(fā)生、發(fā)展過程之中，痰濁、血瘀是重要的病理產(chǎn)物和致病因素之一，脾氣虧虛又是其根本的病機(jī)之一［2-3］。

血管重構(gòu)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡以及基質(zhì)成分的合成、降解、重新排列等過程。血管重構(gòu)又是血管對(duì)刺激所產(chǎn)生的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程，包括信號(hào)的感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子的合成、釋放，最后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的變化，其機(jī)理比較復(fù)雜［4］，目前尚未有完全了解清楚。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，自發(fā)高血壓模型大鼠的心血管重構(gòu)事件均表為膠原纖維的增生，有研究表明［5-6］，高血壓時(shí)血管結(jié)構(gòu)的改變主要機(jī)制為動(dòng)脈血管中膜平滑肌細(xì)胞增殖/凋亡失衡，膠原降解制衡，從而出現(xiàn)肥大、增生以及結(jié)締組織增加等，其結(jié)果是血管壁增厚，壁腔比例明顯加大，血流阻力和血管反應(yīng)性增加，血管順應(yīng)性下降，使重要組織臟器如心、腎等缺血、缺氧，并繼而誘發(fā)器官的重塑。

六君丹參顆粒由陳夏六君子湯配伍丹參飲、水蛭構(gòu)成，臨床上具有健脾益氣、活血化瘀的功效。既往已有該方面的的中醫(yī)藥科研多為運(yùn)用平肝潛陽等方劑進(jìn)行研究，健脾活血化痰作為主流治法的研究尚不多。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，六君丹參顆粒具有顯著的具有逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)的作用，同時(shí)對(duì)重要臟器如心臟的重構(gòu)也有良好的干預(yù)作用，電鏡（圖2）顯示心肌纖維排列有改善，線粒體形態(tài)回復(fù)正常，提示該藥對(duì)受損的心肌有良好的修復(fù)作用，并且安全有效。MMP-2、9是MMPs家族中的明膠酶系，表達(dá)于體內(nèi)各種細(xì)胞和組織之中，包括血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞，參與生理重塑、組織修復(fù)和血管新生，在高血壓病心血管的重塑之中扮演著重要角色［7-8］。研究表明抑制該兩種酶可降低膠原含量，抑制間質(zhì)纖維化，有助于逆轉(zhuǎn)血管重塑［9-10］。但檢測(cè)提示與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該藥對(duì)血管重塑的逆轉(zhuǎn)作用并非通過抑制MMP-2、9而起作用，因此其機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

［1］Lee RMKW，Owens GK，Scott-Burden T，et al.Pathophysiology of smooth muscle in hypertension［J］.Can J Physiologic Phamacol，1995，73：574.

［2］史大卓，馬曉昌，高修安.活血化瘀方藥防治動(dòng)脈粥樣硬化概況［J］.中醫(yī)雜志，1995，36（7）：433-435.

［3］張芬梅，張慧嶺，陳雪玲，等.健脾降濁通脈方治療動(dòng)脈粥樣硬化的臨床觀察［J］.四川中醫(yī)，2007，25（4）：45-46.

［4］Gibbons GH，Dzau VJ.The emerging concept of vascular remodeling［J］.N Engl J Med，1994，330（20）：1431-1438.

［5］Pasterkamp G，Kleijin DPV，BorstC.Arterialre modeling in atherosclerosis，restenosis and after alteration of blood flow：potential mechanis ms and clinical implications［J］.Cardiovascular Res，2000， 45（4）：843-852.

［6］洪華山，吳進(jìn)壽，江瓊.自發(fā)性高血壓大鼠心肌壁內(nèi)小動(dòng)脈的重構(gòu)特征觀察［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34（4）：415-418.

［7］Flaman TM，Placier S，Dubroca C，et al.Role of matrix metallopro-teinase in early hypertension vascular remodeling［J］.Hypertension，2007，50（1）：212-218.

［8］McEniery CM，Wallace S，Dakham Z，et al.Matrixmetalloproteinase-9（MMP-9），MMP-2，and serum elastase activity are associated with systolic hypertension and arterial stiffness［J］.Arterioscler Thromb-Vasc Biol，2005，25：372-37.

［9］Defawe OD，Kenagy RD， Choi C，et al.MMP-9 regulates both positively and negativelycollagen gel contraction：a nonproteolytic function of MMP-9［J］.Cardiovasc Res，2005，66（2）：402-409.

［10］Wang M， Zhang J，Spinetti G，et al.Angiotensin Ⅱ activates matrix metalloproteninase type Ⅱ and mimics age-associated carotid arterial remodeling in young rats［J］.Am J Pathol，2005，167（5）：1429-1442.