張生權(quán)

湖南省張家界市慈利縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南慈利 427200

絞股藍提取物對糖尿病腎病大鼠血液流變學(xué)和炎性因子影響的實驗研究

張生權(quán)

湖南省張家界市慈利縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南慈利 427200

目的 初步探討絞股藍提取物對糖尿病腎病大鼠血液流變學(xué)和炎性因子的影響。 方法 將40只Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、絞股藍大劑量組（5 mg/kg）和小劑量組（2.5 mg/kg）；模型組、大劑量組和小劑量組大鼠使用腹腔注射鏈脲佐菌素方法制作糖尿病腎病模型；絞股藍大小劑量組按照上述劑量給予絞股藍提取物灌胃，1次/d，持續(xù)10周，空白對照組和模型組則給予同劑量蒸餾水灌胃；實驗結(jié)束時腹主動脈取血檢測血液黏度、總膽固醇、三酰甘油及炎癥因子。 結(jié)果 絞股藍提取物可以有效降低糖尿病腎病大鼠血液黏度、血漿黏度及總膽固醇和三酰甘油水平，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時可明顯降低糖尿病腎病大鼠血清TNF-α、IL-6和CRP水平，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 絞股藍提取物具有改善糖尿病腎病大鼠血液流變學(xué)及微炎癥狀態(tài)的作用，值得進一步研究。

糖尿病腎病；絞股藍提取物；血液流變學(xué)；炎癥因子

糖尿病腎?。―N）是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，早期癥狀不明顯，晚期常導(dǎo)致患者慢性腎功能不全，是糖尿病患者的重要死亡原因。在DN的發(fā)生發(fā)展過程中，血流動力學(xué)異常起著關(guān)鍵的作用，甚至可能是始動因素[1]，其次，相關(guān)研究表明以腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）及 C反應(yīng)蛋白（CRP）為代表的炎癥介質(zhì)，也被認為對DN的發(fā)病起著不同程度的促進作用[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明絞股藍具有降低血脂、降血壓、防止衰老、抑制腫瘤、增強免疫力、鎮(zhèn)靜止痛、保護心臟和肝臟、抗動脈粥樣硬化、保護血管等作用[3]。有關(guān)絞股藍提取物對DN患者血液流變學(xué)及炎癥因子影響的基礎(chǔ)研究鮮有報道，因此筆者以該立據(jù)為切入點進行了實驗研究，現(xiàn)總結(jié)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取1.5 kg絞股藍（購自綏寧縣華潤絞股藍制品廠），用搗碎機搗碎，過濾殘渣，濾液備用，將殘渣用950 mL/L乙醇對流提取2次，每次1 h，合并濾液，減壓回收至無乙醇味。分別予石油醚及乙酸乙酯萃取，最后用蒸餾水稀釋，制成不同濃度的絞股藍乙酸乙酯提取物保存?zhèn)溆肹4]；上述流程均在本院藥劑科完成。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，由由北京中生瑞泰科技有限公司提供）；大鼠 TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒（96T，由上海軒昊科技發(fā)展有限公司提供）；CRP免疫比濁法試劑盒（由北京綠源博德生物科技有限公司提供）；0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（生產(chǎn)批號：T2011467，由北京化工廠生產(chǎn)）；血糖試紙（由德國寶麗曼公司提供）；血液流變儀（型號：LB-2AV，由上海富眾生物科學(xué)有限公司提供）；全自動生化分析儀（型號：GRT3000，由濟南格利特公司提供）。

1.3 實驗動物

Wistar大鼠40只 （由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技公司提供），雌雄各半，6～8 周齡，體重 200～230 g，清潔級，普通喂養(yǎng)，自由進食。

1.4 DN模型制作

Wistar大鼠購入后進行適應(yīng)性喂養(yǎng)，1周后按照文獻[5]中的方法對隨機抽取的30只大鼠建模，具體如下：空腹10 h后注射STZ（用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將STZ配制成濃度為1%的溶液，按40 mg/kg劑量注入大鼠腹腔內(nèi)）；每周采大鼠尾部靜脈血（空腹12 h），使用血糖試紙測定血糖，當(dāng)血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L時可判定為大鼠糖尿病模型；STZ注射2周后，尿常規(guī)測定出尿蛋白陽性時，判定為DN形成。

1.5 分組及給藥方法

10只未作任何處理的大鼠設(shè)立為空白對照組（A組）；30只建模成功的大鼠隨機分為模型組 （B組）、絞股藍大劑量組（C組）和小劑量組（D組）；絞股藍大小劑量組分別按5 mg/kg和2.5 mg/kg灌胃給藥，每日1次；空白對照組和模型組按同容積蒸餾水進行灌胃，每日1次，共持續(xù)10周。

1.6 標本采集

造模后第0、2、5、8及10周，采大鼠空腹尾尖血進行血糖測試；造模后第10周時，禁食禁水12 h，乙醚麻醉下處死動物，經(jīng)腹主動脈取血，分2份后-80℃獨立保存待測。

1.7 指標檢測

（1）血液流變學(xué)檢測：一份血液標本經(jīng)EDTA抗凝，用LB-2AV 血液流變儀分別測定高切（94.5 s-1）、低切（0.945 s-1）、全血黏度及血漿黏度，采用全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）；（2）炎癥因子測定：另一份血液標本離心分離血清，使用ELISA法測定大鼠TNF-α、IL-6，使用免疫比濁法測定CRP，均按照試劑盒說明書嚴格操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

實驗期間共有4只大鼠死亡，其中B組死亡2只，C組和D組各死亡1只；B組多只大鼠體重出現(xiàn)明顯下降，可見多飲、多食及多尿，不同程度出現(xiàn)精神萎糜、反應(yīng)遲鈍、毛豎無光澤及動作遲緩等不良反應(yīng)，而C組和D組大鼠精神、活動情況及反應(yīng)靈敏度均明顯優(yōu)于B組。

2.1 血液流變學(xué)

給藥10周后，模型對照組、絞股藍大劑量組和小劑量組的全血黏度、血漿黏度以及TC和TG水平，均高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；絞股藍大劑量組與小劑量組全血黏度及血漿黏度，均較低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；絞股藍大劑量組與小劑量組大鼠的總膽固醇和三酰甘油水平均低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而無論血液黏度、血漿黏度，還是總膽固醇及三酰甘油水平，絞股藍大劑量組與小劑量組比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠第10周血液流變學(xué)指標檢測結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠第10周血液流變學(xué)指標檢測結(jié)果（±s）

注：與 A 組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與 B組比較，cP＜0.05；與 C組比較，dP＞0.05

組別 例數(shù)（n）全血黏度（mPa·s）高切 低切血漿黏度（mPa·s）TC（mmol/L）TG（mmol/L）A組10 B組C組D組8 9 9 4.39±0.51 6.27±0.38a 5.01±0.29bc 5.12±0.17bcd 8.32±1.21 15.49±1.57a 12.35±1.69ac 12.46±1.58bcd 0.59±0.27 1.28±0.15a 0.91±0.22bc 0.93±0.18bcd 1.82±0.55 3.27±0.89a 2.45±0.47bc 2.38±0.41bcd 0.93±0.29 1.78±0.91a 1.05±0.37bc 1.07±0.15bcd

2.2 炎癥因子

給藥10周后，絞股藍大劑量組與小劑量組TNF-α、IL-6和CRP水平，均低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但大劑量與小劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 2。

表2 各組大鼠第10周炎癥因子檢測結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠第10周炎癥因子檢測結(jié)果（±s）

注：與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.01；與C組比較，cP＞0.05

組別 例數(shù)（n）TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）CRP（μg/mL）A組10 B組C組D組8 9 9 51.39±6.87 140.21±8.69a 93.51±7.23abc 94.25±6.91abc 11.39±2.33 27.47±1.54a 21.08±1.27abc 21.33±1.09abc 68.34±19.85 99.21±17.37a 75.29±14.85abc 76.33±15.67abc

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，高血糖、脂代謝紊亂、血流動力學(xué)及血流變性的異常等是糖尿病腎病發(fā)病的原因，同樣也是導(dǎo)致糖尿病腎病進展的原因[6]。血液流變學(xué)的異常是糖尿病微循環(huán)障礙的主要原因之一，微血管并發(fā)癥是DN發(fā)生發(fā)展過程中的重要不利因素，血液流變學(xué)的異常往往在微血管并發(fā)癥出現(xiàn)之前就已存，并且不同程度地促進了并發(fā)癥的發(fā)生，糖尿病患者血液流變學(xué)異常時的主要表現(xiàn)為血液呈高凝狀態(tài)、血液流速減慢和微血栓形成[7-8]。本組研究顯示，DN造模成功的大鼠同正常大鼠比較，均不同程度存在血液流變學(xué)的異常，主要是全血黏度（高切及低切）、血漿黏度、總膽固醇和三酰甘油的異常升高。同時，近年來眾多研究結(jié)果顯示體內(nèi)微炎癥狀態(tài)與DN的發(fā)病密切相關(guān)，巨噬細胞、T細胞等免疫細胞在多種黏附因子、趨化因子和細胞因子的作用下在腎臟募集，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，加重血管損傷和基質(zhì)纖維化[9]，上述免疫細胞通過分泌產(chǎn)生此類炎癥因子來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答作用，并最終參與了炎癥反應(yīng)。本組研究結(jié)果顯示，經(jīng)STZ誘導(dǎo)制作的DN大鼠模型，TNF-α、IL-6和CRP的水平明顯高于正常組大鼠。因此，本研究顯示了血液流變學(xué)的異常和炎癥因子的過度表達，與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有不同程度的促進作用。

絞股藍是葫蘆科絞股藍屬多年生攀緣草質(zhì)藤本植物，又稱七葉膽、公羅鍋底，它以全草供藥食兼用，味苦、性寒，具有清熱解毒、補氣、止咳、祛痰之功效。研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍具有多種生物活性，如調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、降低血脂、心血管保護等；含有多種化學(xué)成分，其中絞股藍多糖是其活性成分之一[10]。國內(nèi)相關(guān)學(xué)者[11-13]發(fā)現(xiàn)，絞股藍顆粒對糖尿病腎病大鼠血管活性物質(zhì)表達的影響，發(fā)現(xiàn)其可顯著減少腎組織NO含量，改善早期DN腎小球高灌注、高濾過的狀態(tài)，延緩腎小球硬化，同時減少AGEs形成、抑制RAGE基因表達、降低血糖、減少TGF-β分泌、抑制細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和積聚，減少糖尿病腎病小鼠的蛋白尿、保護腎功能。本組研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍提取物可以有效改善DN大鼠血液流變學(xué)，并降低血清內(nèi)TNF-α、IL-6和 CRP水平。

綜上所述，絞股藍提取物具有改善糖尿病腎病大鼠血液流變學(xué)及微炎癥狀態(tài)的作用，值得進一步研究。

[1]Rodriguez F，Lopez B，Perez C，et al.Chronic tempol treatment attenuates the renal hemodynamic effects induced by a heme oxygenase inhibitor in streptozotocin diabetic rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，301（5）：1540-1548.

[2]Yeo ES，Hwang JY，Park JE，et al.Tumor necrosis factor （TNF-alpha）and C-reactive protein （CRP） are positively associated with the risk of chronic kidney disease in patients with type 2 diabetes[J].Yonsei Med J，2010，51（4）：519-525.

[3] 樸香蘭，吳搖倩.絞股藍研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1758-1760.

[4]王宏濤，葉云，肖順林，等.絞股藍乙酸乙酯提取物對胃潰瘍大鼠胃黏膜血管活性物質(zhì)的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2008，17（10）：1437-1438.

[5]齊偉，牟嬌，葉自林，等.4-苯丁酸鈉對大鼠糖尿病腎病的治療作用[J].中國糖尿病雜志，2010，18（10）：781-785.

[6]沙洪，趙東，張浩軍，等.糖腎方對糖尿病腎病大鼠血液流變及其相關(guān)因素的影響[J].中國血液流變學(xué)雜志，2010，20（3）：383-384.

[7]Velcheva I，Damianov P，Mantarova S，et al.Hemorheology and heart rate variability in patients with diabetes mellitus type 2[J].Clin Hemorheol Microcirc，2011，49（1-4）：513-518.

[8]謝毅娟，陳雪梅，梁國華.血清胱抑素C、糖化血紅蛋白及血液流變學(xué)與 2 型糖尿病腎病的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（4）：496-498.

[9]王玉梅，黎慧清，李貞瓊，等.羅格列酮對糖尿病大鼠腎臟IL-6、IL-8、TNF-α 表達的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）：2010，39（6）：802-805.

[10]杜小燕，侯穎，覃華，等.絞股藍多糖對2型糖尿病大鼠血糖的影響及其機制初步研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2011，11（24）：5754-5758.

[11]陳丹，黃平.絞股藍防治糖尿病腎病研究[J].吉林中醫(yī)藥，2011，31（7）：686-687.

[12]金李君.絞股藍顆粒對早期糖尿病腎病模型大鼠腎臟NO/NOS表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011 年，21（9）：601-604.

[13]沈楠，許文頻，李敏，等.絞股藍皂苷對高脂血癥大鼠脂代謝的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9（9）：1081-1083.

The experimental study of Gynostemma extract for the hemorheology and inflammation factors of rat with diabetic nephropathy

ZHANG Shengquan
Department of Nephrology,Cili County People′s Hospital of Zhangjiajie City in Hu′nan Province,Cili42720,China

ObjectiveTo investigate the effects of Gynostemma extract on the hemorheology and inflammation factors of diabetic nephropathy rats.MethodsForty wistar rats were randomly divided into control group,model group,high-dose of Gynostemma group (5 mg/kg)and low-dose of Gynostemma group (2.5 mg/kg);streptozotocin injection were given to the rats in model group,high-dose Gynostemma group and low-dose Gynostemma group by intraperitoneal as the diabetic nephropathy models.The rats in high and low dose of Gynostemma groups were given the above dose of Gynostemma extract by intragastric administration,1 time/d,for 10 weeks;The rats in blank control group and model group were treated with the same dose of distilled water.The viscosity,total cholesterol,triglycerides and inflammatory factors were detected by extracting the abdominal aortic blood of all rats at end of the experiment.ResultsThe blood level of viscosity,plasma viscosity,total cholesterol and triglyceride in rats with diabetic nephropathy were effectively reduced by Gynostemma extract,comparing with model group,and the difference had statistical significance(P<0.05);Meanwhile,the blood level of TNF-α,IL-6 and CRP were either lowered by Gynostemma extract,compared with model group,the difference had statistical significance(P<0.05).ConclusionGynostemma extract can effectively improve the hemorheology and micro-inflammatory state of the rats with diabetic nephropathy,which deserves further study.

Diabetic nephropathy;Gynostemma extract;Hemorheology;Inflammatory factors

R-33

A

1674-4721（2012）11（b）-0012-03

2012-07-20 本文編輯：林利利）