李 建，潘康成

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安 625014)

人工反硝化細(xì)菌能有效去除硝酸鹽［1］，充足的碳源對固定化細(xì)菌的反硝化作用是必要的［2］，碳源是影響脫氮的主要因素之一［3］。環(huán)境中碳源不能滿足需要時，就必須投入其他碳源，以保證反硝化脫氮作用繼續(xù)進(jìn)行［4］。碳源一直是異養(yǎng)反硝化作用的研究重點［5］，甲醇、乙酸等有機(jī)物可作為反硝化過程所需的外加碳源［6－8］。為尋找高效、經(jīng)濟(jì)的外加碳源，探索反硝化細(xì)菌的發(fā)酵工藝，本實驗對葡萄糖、酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙酸、乙醇等碳源對反硝化細(xì)菌生長的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種 反硝化細(xì)菌XF03株(兼性厭氧)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院發(fā)酵工程實驗室提供。

1.2 儀器 PYX－DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、電子天平。

1.3 試劑 酒石酸鉀鈉、葡萄糖、蔗糖、乙醇、冰乙酸、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、蒸餾水、液體石蠟、NaOH、NaCl。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 KNO32.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.41 g［9］，酒石酸鉀鈉 20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2，115 ℃ 滅菌備用，用于種子液培養(yǎng);在液體培養(yǎng)基中加0.7%(W/V)瓊脂粉，制成瓊脂平板培養(yǎng)基，用于活菌計數(shù)。

1.4.2 不同碳源培養(yǎng)基的制備 制備5種不同碳源培養(yǎng)基。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳、氮源濃度及C/N為參比，其他物質(zhì)不變，計算出其他碳源添加量(表1)，配制完畢，滅菌保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 5種液體培養(yǎng)基中碳源添加量

1.5 接種培養(yǎng) 取XF03株斜面菌種接種基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，用滅菌的液體石蠟覆蓋其表層，置于燭缸中35℃恒溫培養(yǎng)4 d后，進(jìn)行活菌計數(shù)。然后取1 mL種子液分別接種9 mL上述5種不同的液體培養(yǎng)基，用滅菌的液體石蠟覆蓋其表層，置于35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2、4、6 d后進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.6 活菌計數(shù) 采用平板計數(shù)法，進(jìn)行活菌計數(shù)。取1 mL培養(yǎng)液加入9 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適當(dāng)稀釋度的菌液滴基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平皿3個，0.1 mL/個，使菌液均勻散開，置于燭缸中35℃培養(yǎng)4 d后計數(shù)菌落，計算活菌數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 對活菌計數(shù)結(jié)果進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種不同碳源對反硝化細(xì)菌生長的影響 5種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌活菌數(shù)如表2所示。

表2 5種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌XF03株活菌數(shù) CFU/mL

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 培養(yǎng)時間對細(xì)菌增殖的影響 含葡萄糖的菌液中，活菌數(shù)在 0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶1.6 ∶133.7∶215.5。含酒石酸鉀鈉的菌液中，活菌數(shù)在0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶15.4 ∶33.1 ∶40。含蔗糖的菌液中，活菌數(shù)在0、2、4、6 d 的比值為1 ∶4.8 ∶8.1 ∶16.4。含乙酸的菌液中，活菌數(shù)在 0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶1.9 ∶3.8 ∶13.1。含乙醇的菌液中，活菌數(shù)在0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶4.1 ∶5.5 ∶8.7。0 ～6 d細(xì)菌生長速度順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉＞蔗糖＞乙醇(或乙酸)(此處以碳源代表含此碳源的菌液，下同)。在5種液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌在0～4 d培養(yǎng)時間越長，活菌數(shù)越高，活菌減少最早可能發(fā)生于4 d后，因此在相同條件下進(jìn)行菌種增殖，培養(yǎng)時間不宜少于4 d。

2.2.2 不同碳源對細(xì)菌生長的影響 接種后2 d，活菌數(shù)順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉＞蔗糖＞乙醇＞乙酸，其比值為4.1 ∶3.8 ∶1.2 ∶1 ∶0.5。對有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗表明，葡萄糖與乙醇、葡萄糖與乙酸、酒石酸鉀鈉與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙酸活菌數(shù)差異顯著;其余的菌液活菌數(shù)彼此之間差異不顯著。如果增殖培養(yǎng)2 d，添加葡萄糖或酒石酸鉀鈉效果較好。

接種后4 d，活菌數(shù)順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉 ＞ 蔗糖 ＞ 乙醇 ＞ 乙酸，其比值為24.3 ∶6.0 ∶1.5 ∶1∶0.7。對有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗表明，葡萄糖與乙酸、葡萄糖與酒石酸鉀鈉、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙酸活菌數(shù)差異極顯著;酒石酸鉀鈉與蔗糖活菌數(shù)差異顯著;其余的菌液活菌數(shù)彼此差異不顯著。如果增殖培養(yǎng)4 d，添加葡萄糖效果最好，添加酒石酸鉀鈉效果稍差一些。

接種后6 d，活菌數(shù)順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉 ＞ 蔗糖 ＞ 乙酸 ＞ 乙醇，其比值為24.4 ∶4.6 ∶1.9 ∶1.5∶1。對有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗表明，葡萄糖與乙酸、葡萄糖與酒石酸鉀鈉、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與乙醇活菌數(shù)差異極顯著;酒石酸鉀鈉與乙醇活菌數(shù)差異顯著;其余的菌液細(xì)菌濃度彼此差異不顯著。如果增殖培養(yǎng)6 d，添加葡萄糖效果較好。

綜上所述，在 35 ℃、pH 7.2、C/N=19的條件下，葡萄糖作為碳源對反硝化細(xì)菌XF03株生長的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于其余4種碳源。

3 討論和結(jié)論

本實驗研究表明相對于酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙醇和乙酸，在C濃度相同的情況下，葡萄糖作為唯一碳源更有利于反硝化細(xì)菌XF03株的增殖，能獲得較多的活菌。

反硝化實質(zhì)上是氮的還原［10］，可以碳源作為電子供體［11］。電子供體為單一碳源有機(jī)物時，的降解速率受NO－3－N濃度和碳源有機(jī)物濃度的雙重影響［12］。反硝化細(xì)菌利用不同碳源，通過不同的呼吸途徑，產(chǎn)生的能量不同，細(xì)胞的產(chǎn)率也不同［13］。有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞的百分率越大，對其需求量越?。?4］。反硝化細(xì)菌的細(xì)胞產(chǎn)率與碳源性質(zhì)間的關(guān)系非常密切［15］。

需氧反硝化細(xì)菌可在有氧的條件下進(jìn)行反硝化，菌種擴(kuò)大培養(yǎng)相對容易。厭氧反硝化細(xì)菌可在厭氧的條件下進(jìn)行反硝化，反硝化的效率較高，一般為自養(yǎng)型，可在無外源有機(jī)物的情況下完成增殖。兼性厭氧菌對溶解O2的濃度沒有嚴(yán)格要求，適用范圍更廣，能在偏酸性環(huán)境中生長，適于治理大面積水體N污染。

利用葡萄糖、酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙酸和乙醇分別作為唯一碳源對比研究其對反硝化細(xì)菌增殖的影響，以找到適用于反硝化細(xì)菌增殖的最佳碳源。反硝化細(xì)菌XF03株以葡萄糖作為碳源進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)和生物脫氮，具有較高的性價比和在生產(chǎn)中運用的現(xiàn)實性。

本實驗通過活菌計數(shù)結(jié)果來反映不同碳源對反硝化細(xì)菌生長的影響，在細(xì)菌進(jìn)入衰退期之前，菌液中的活菌數(shù)可有效地反映細(xì)菌的生長狀況，活菌數(shù)越多，表明碳源越易被分解利用，細(xì)菌生長越迅速，碳源對該菌株增殖的促進(jìn)作用越好，而且在實際應(yīng)用中活菌數(shù)也是評價細(xì)菌生長狀況及其應(yīng)用價值的一個重要指標(biāo)。反硝化細(xì)菌XF03株作為兼性厭氧菌，比較適合用于NO－3污染的富營養(yǎng)化水體的生物脫氮。

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