楊 梅,許崇利,2
(1.吉林化工學院環(huán)境與生物工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,長春 130062)
白細胞介素 -15(Interleukin-15,IL-15)是Grabstein[1]于1994年發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子,與IL-2具有類似的生物活性。它具有促進T細胞、NK細胞和B細胞的增殖和分化,誘導淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ及TNF-α的作用[2]。近年來的研究表明,IL-15在抗腫瘤、抗微生物感染和治療艾滋病等方面均有重要的作用[3-5]。人體多種組織和細胞均可表達IL-15,其中骨骼肌、胎盤、腎臟、骨髓基質(zhì)細胞及脂多糖刺激的外周血單核細胞表達較豐富。IL-15有其自身高親和力的特異性受體IL-15Rα,IL-15與其受體IL-15Rα的親和力是IL-2與 IL-2 Rα 的 1000倍[2],將有可能代替IL-2成為抗感染、抗腫瘤強有力的生物制劑。但是天然IL-15產(chǎn)量低、不易大量制備,為此本實驗構(gòu)建了表達IL-15蛋白的基因工程菌株,實現(xiàn)了高效表達,并對其表達條件進行了優(yōu)化研究,從而為IL-15生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗數(shù)據(jù)。
1.1 菌株 菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)由吉林化工學院基因工程藥物實驗室構(gòu)建。
1.2 培養(yǎng)基 M9Ⅰ培養(yǎng)基:1.6%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%磷酸氫二鉀、0.1%磷酸二氫鉀、0.01% 氯化銨、0.06% 硫酸銨、0.05% 硫酸鎂、0.25%十二水磷酸氫二鈉;M9Ⅱ培養(yǎng)基:0.5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.5% 磷酸氫二鉀、0.35% 磷酸二氫鉀、0.35% 磷酸氫二銨、0.025% 硫酸鎂、2 mol/L大腸桿菌用微量元素;M9Ⅲ培養(yǎng)基:0.5%酪蛋白、0.52%三水磷酸氫二鉀、0.2%磷酸二氫鉀、0.12%硫酸銨、0.05% 硫酸鎂、0.02% 氯化銨、0.1%甘油、0.7% 十二水磷酸氫二鈉、0.1mol/L 氯化鈣、2 mol/L大腸桿菌用微量元素。
1.3 主要試劑 乳糖和卡那霉素(Kanamycin)購自Promega公司;β-巰基乙醇購自北方同正生物公司;蛋白Marker購自長春寶泰克生物公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、過硫酸胺(AP)購自華美生物公司;凝膠成像儀、電泳儀購自Bio-Rad公司。
2.1 搖瓶種子的培養(yǎng) 挑取BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)單菌落轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中,50 mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基20 mL(含50 μg/mL卡那霉素),37℃ 200 r/min培養(yǎng)12~14 h。
2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,含50 μg/mL卡那霉素),200 r/min,37℃培養(yǎng),37℃誘導。
2.3 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對IL-15表達影響 將種子液按2%接種量分別接種于三種改良的M9培養(yǎng)基(M9Ⅰ、M9Ⅱ、M9Ⅲ)中,于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度 OD600達到1.0時,加入終濃度為1.5 g/L的乳糖,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取樣,SDS-PAGE檢測 IL -15 表達量[6-7]。
2.4 發(fā)酵初始pH對IL-15表達的影響 將M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值分別調(diào)為 6.5、7.0、7.5,然后分裝于200 mL錐形瓶中,每瓶50 mL,按2%接種,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達到1.0時,加入終濃度為1.5 g/L的乳糖,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,進行蛋白表達檢測。
2.5 乳糖最佳誘導濃度對IL-15表達的影響將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達到1.0 時,分別加入終濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的乳糖,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,進行蛋白表達檢測。
2.6 誘導溫度對IL-15表達的影響 將M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至7.0,然后分裝于200 mL錐形瓶中,每瓶50 mL,按2%的接種量接種BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)種子液,分別于28、35、37 ℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達到1.0時,加入終濃度為1.5 g/L的乳糖,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,進行蛋白表達檢測。
2.7 培養(yǎng)和誘導時間對IL-15表達的影響 將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達到1.0時,加入終濃度為1.5 g/L的乳糖,分別于1、2、3、4、5 h取樣,進行蛋白表達檢測。
3.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對IL-15表達影響 如圖1所示,IL-15在三種改良的M9發(fā)酵培養(yǎng)基中均有表達,但在M9Ⅱ培養(yǎng)基中的表達量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量30.2%(圖1)。
圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
3.2 發(fā)酵初始pH對IL-15表達的影響 如圖2所示,不同初始pH值對IL-15蛋白表達水平有明顯影響,其中pH值為7.0時,IL-15蛋白表達量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的29.6%(圖2)。因此,選擇 pH 7.0為最佳初始pH值條件。
3.3 誘導劑濃度對IL-15表達的影響 如圖3所示,不同的乳糖濃度對IL-15蛋白表達量的影響不同,當乳糖濃度達到1.5 g/L時IL-15蛋白表達量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的32.3%(圖3)。因此乳糖濃度控制在1.5 g/L較好,可以得到更高的表達水平。
圖2 不同pH值發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
圖3 不同濃度乳糖誘導發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
3.4 誘導溫度對IL-15表達的影響 如圖4所示,不同培養(yǎng)溫度對IL-15蛋白表達量有較大的影響,當培養(yǎng)溫度為37℃時IL-15蛋白表達量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量36%(圖4)??紤]到菌體生長速度,最后確定搖瓶培養(yǎng)溫度為37℃,誘導溫度為37℃。
圖4 不同培養(yǎng)溫度發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
3.5 不同培養(yǎng)、誘導時間對IL-15表達的影響在對數(shù)生長前期進行誘導,最有利于菌體生長和產(chǎn)物表達。只有工程菌處于對數(shù)生長時期,目的蛋白表達水平才最高,一旦工程菌進入穩(wěn)定生長期再升溫,目的蛋白表達水平反而會迅速下降。如圖5所示,當誘導時間為4 h時,IL-15蛋白表達量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的30.7%。因此,選擇4 h為最佳誘導時間。
圖5 不同誘導時間發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
乳糖以其無毒、價廉的特點,使得人們期望能夠利用乳糖作為工業(yè)化生產(chǎn)的誘導物。然而,由于乳糖本身會引起細胞在轉(zhuǎn)運以及生理代謝等方面的一系列復雜的變化,需要對菌體生長及誘導條件進行更為精細的研究及優(yōu)化。本文深入研究了以乳糖作為誘導劑時,對T7啟動子調(diào)控的重組產(chǎn)物表達及菌體生長的影響及其規(guī)律,從中分析并尋找出適宜的誘導條件及誘導物濃度。
摸索搖瓶發(fā)酵條件對確定發(fā)酵罐發(fā)酵工藝有著一定的借鑒意義[8-10],本實驗優(yōu)化的發(fā)酵條件為發(fā)酵起始pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、乳糖誘導濃度1.5 g/L、菌體生長密度OD600達到1.0時加入乳糖、誘導時間為4 h。本實驗優(yōu)化的發(fā)酵條件是穩(wěn)定的,在后續(xù)的工作中,可以此為方向進行發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的摸索,從而為乳糖作為誘導劑最終應用于重組基因工程藥物IL-15的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考和借鑒。
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