廖園園，朱 薇，李 建，王 威，秦 偉，漆世華，李晶梅，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長緩慢、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征。除了引發(fā)PMWS外，PCV2還與豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、豬增生性壞死性肺炎(PNP)、仔豬先天性震顫(CT)、母豬繁殖障礙等疾病相關(guān)［1］。Cap蛋白是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有4個抗原表位，具有較好的免疫原性和抗原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原表位，也是現(xiàn)在基因工程疫苗研究的熱點蛋白。為建立一種敏感、特異、快速的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白檢測方法，使PCV2基因工程苗的質(zhì)控更快更準(zhǔn)更方便，本研究利用雙抗體夾心法建立了一種檢測PCV2 Cap蛋白的方法，并初步應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒2型亞單位基因工程疫苗的質(zhì)量檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)細(xì)胞毒樣品、細(xì)小病毒PPV樣品、繁殖呼吸道綜合征病毒PRRSV樣品、豬瘟病毒CSFV樣品和PCV1樣品由武漢中博生物股份有限公司實驗室保存;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗及TMB購自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)購自Ameresco公司;BCA蛋白定量試劑盒購自GE公司;酶標(biāo)板購自深圳金燦華公司;其他化學(xué)試劑主要來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司(分析純)。其他主要設(shè)備有包被機(jī)、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫孵育箱。

1.1.2 PCV2 Cap蛋白的制備 提取豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因組，通過設(shè)計特異性引物擴(kuò)增ORF2基因片段，利用 Bac－to－Bac系統(tǒng)構(gòu)建能表達(dá)PCV2－ORF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒，將該重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，收獲表達(dá)的Cap蛋白，通過CsCl密度梯度離心純化后作為檢測的抗原標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.3 PCV2多抗和單抗的制備 PCV2 Cap蛋白常規(guī)免疫健康家兔，待兔血清中 PCV2抗體用ELISA方法檢測效價達(dá)1∶1000以上，即可采血分離血清。分離的血清通過辛酸－硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，獲得所需抗PCV2抗原純化多抗。

應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備單抗，PCV2 Cap蛋白常規(guī)免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細(xì)胞，將脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用ELISA方法和IFA(間接免疫熒光)方法鑒定抗PCV2的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行三次亞克隆化［2］后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗PCV2的單克隆抗體，通過辛酸－硫酸銨沉淀法將腹水進(jìn)行純化，獲得的即為所需抗PCV2單克隆抗體。

1.2 ELISA方法的建立

1.2.1 最佳抗體包被濃度、單抗使用濃度和二抗使用濃度的確立 按照方陣滴定方法優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件。以pH 9.6碳酸鹽緩沖液將純化的抗PCV2－ Cap 多抗稀釋至終濃度為 0.5、1、2、4 μg/mL，100 μL/孔包板，4 ℃ 過夜。PBST 洗板后，加1%BSA封閉2 h?？乖瓨?biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋，濃度為 3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0 μg/mL，100 μL/孔，同時設(shè)陰性對照，37 ℃，1 h。PBST 洗板后，分別加入終濃度為1、2、4 μg/mL 的抗 PCV2 －Cap單抗，100 μL/孔，37 ℃，1 h。PBST 洗板后，分別加入1∶20000、1∶40000、1∶80000稀釋的二抗，100 μL/孔，37 ℃，1 h。PBST 洗板后加入 TMB 底物溶液，100 μL/孔，37 ℃ 10 min。加入1 mol/L 的H2SO450 μL/孔，終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀 450 nm 讀數(shù)，每個稀釋度重復(fù)一次，取其平均值。應(yīng)用軟件CurveExper進(jìn)行結(jié)果分析［3］。

1.2.2 封閉液的確定 以最佳多抗?jié)舛劝幻笜?biāo)板，洗滌，分別用含 0.5%BSA、1%BSA、1.5%BSA、2%BSA、5%脫脂乳、2%明膠［4］及1%BSA+0.5%酪蛋白的 PBST，200 μL/孔，37 ℃封閉2 h，抗原標(biāo)準(zhǔn)品按1.2.1項方法稀釋，進(jìn)行ELISA測定，其他步驟同1.2.1項。比較各組陰、陽性樣品的OD值和P/N值以選擇合適的封閉液。

1.2.3 封閉時間的選擇 以最佳多抗?jié)舛劝幻笜?biāo)板，洗滌，用確定的封閉液200 μL/孔，分成3組，分別為37℃ 封閉1 h，37℃ 2 h，37℃ 3 h，4℃24 h。封閉后，抗原標(biāo)準(zhǔn)品按1.2.1項方法稀釋，進(jìn)行ELISA測定，其他步驟同1.2.1項。比較各組陰、陽性樣品的OD值和P/N值，以選擇合適的封閉時間。

1.2.4 單抗反應(yīng)時間的確定 酶標(biāo)板按照確定的條件包被和封閉后，抗原標(biāo)準(zhǔn)品按1.2.1項方法稀釋，進(jìn)行ELISA測定，單抗反應(yīng)時間分別為30、45、60、75 min，其他步驟同 1.2.1 項。比較各組陰、陽性樣品的OD值和P/N值，以選擇最佳單抗反應(yīng)時間。

1.2.5 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定 酶標(biāo)板按照確定的條件包被和封閉后，抗原標(biāo)準(zhǔn)品按1.2.1項方法稀釋，進(jìn)行ELISA測定，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間分別為30、45、60、75 min，其他步驟同 1.2.4 項。比較各組陰、陽性樣品的OD值和P/N值，以選擇最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間。

1.2.6 特異性試驗 分別取Sf9陰性細(xì)胞裂解樣品、BSA、PRV細(xì)胞毒樣品、PPV樣品、PRRSV樣品、CSFV樣品、PCV1樣品、PCV2基因工程苗樣品，1∶10和1∶100稀釋后進(jìn)行ELISA測定。同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照。

1.2.7 重復(fù)性試驗 取3個不同批次的試劑盒，分別檢測PCV2基因工程苗樣品和陰性細(xì)胞樣品，每份樣品重復(fù)檢測4次，計算批內(nèi)及批間變異系數(shù)。

1.2.8 比較試驗 分別應(yīng)用本方法和蛋白電泳及BandScan軟件進(jìn)行蛋白含量分析，兩種方法對三批PCV2基因工程疫苗進(jìn)行檢測，比較結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 最佳抗體包被濃度、單抗使用濃度和二抗使用濃度的確立 方陣試驗如表1所示，相關(guān)系數(shù)(γ)值越高、標(biāo)準(zhǔn)誤(S)值越低的組別，包被條件和單抗及二抗?jié)舛鹊臈l件越佳。確定多抗最佳包被濃度為1 μg/mL，單抗最佳濃度為2 μg/mL，二抗最 佳稀釋度為1∶40000。

表1 PCV2－Cap ELISA方陣滴定實驗結(jié)果分析

2.2 封閉液的確定 結(jié)果見表2。1%BSA的P/N值最高，封閉效果最好。

表2 封閉液的確定

2.3 最佳封閉時間的確定 結(jié)果見表3。用1%BSA封閉2 h的效果最好。

表3 封閉時間的確定

2.4 最佳單抗反應(yīng)時間的確定 結(jié)果見表4。當(dāng)反應(yīng)時間為60 min的時候，效果最佳，P/N值最高。

表4 單抗反應(yīng)時間的確定

2.5 最佳二抗反應(yīng)時間的確定 結(jié)果見表5。當(dāng)二抗反應(yīng)時間為60 min的時候，效果最好。

表5 二抗反應(yīng)時間的確定

2.6 特異性試驗 用該方法分別檢測Sf9陰性細(xì)胞裂解樣品、BSA、PRV細(xì)胞毒樣品、PPV樣品、PRRSV樣品、CSFV樣品和PCV1樣品，結(jié)果均為陰性;檢測PCV基因工程苗樣品為陽性，最低檢測量可達(dá)5 ng。標(biāo)明該方法具有很好的特異性和靈敏度。

2.7 重復(fù)性試驗 該方法制備的3批試劑盒檢測PCV2基因工程苗樣品和陰性細(xì)胞樣品的結(jié)果為:批內(nèi)變異系數(shù)2% ～4%，批間變異系數(shù)3% ～6%，均小于10%，表明該方法有較好的重復(fù)性。

2.8 比較試驗 通過對三批PCV2基因工程疫苗樣品檢測發(fā)現(xiàn):雙抗體夾心法檢測結(jié)果分別為60、87、102 μg/mL。對應(yīng)蛋白電泳及BandScan軟件分析的 Cap 蛋白含量分別為 66、92、110 μg/mL，實驗結(jié)果表明這兩種方法檢測結(jié)果差異不大。

3 討論

目前，國內(nèi)外采用的PCV2檢測技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)、間接免疫熒光、免疫酶單層實驗(IMPA)、原位雜交(ISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。其中PCR熒光定量檢測方法靈敏度高，是現(xiàn)在實驗室檢測PCV2病毒的首選方法。但是此方法使用的儀器昂貴，對操作人員要求較高，不適合推廣普及到基層單位和豬場。本研究利用雙抗體夾心法建立了一種檢測PCV2 Cap蛋白的方法，并初步應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒2型亞單位基因工程疫苗的質(zhì)量檢測，使用效果好。

本方法建立的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)品的制備，PCV基因組由一條共價閉合環(huán)狀單股DNA構(gòu)成，包含兩個大的開放閱讀框架ORF1和ORF2，分別編碼病毒蛋白復(fù)制酶(Rep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。由于該病毒在體外培養(yǎng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變，病毒繁殖能力低，難于獲得高產(chǎn)量的病毒抗原用于診斷目的。本方法中的Cap蛋白來源于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，本系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高、免疫活性好、產(chǎn)物易純化、反應(yīng)背景低，在多種動物疫病診斷中得到應(yīng)用［5］。同時還建立了檢測PCV2衣殼蛋白抗體水平的方法，用以反映PCV2的抗體水平，對豬群PCV2抗體水平進(jìn)行監(jiān)測，以確切了解豬體免疫水平或感染狀況。這兩種方法的建立，為有效預(yù)防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因該病發(fā)生而引起重大經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。

本研究初步建立了一種PCV2－Cap抗原檢測方法，后續(xù)工作還需要完成試劑盒的組裝以及試劑盒敏感性、特異性和穩(wěn)定性的研究并加強(qiáng)試劑盒的優(yōu)化。

［1］ 龔乾龍，王 歡，鄧治邦.檢測豬圓環(huán)病毒方法的研究進(jìn)展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，(6):17 －19.

［2］ Ed Harlow，David Lane.Antibodies:A Laboratory manual［M］.Publisher:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988:139 －240.

［3］ 王 伶，楊人強(qiáng)，游志剛，等.巧用CurveExpert軟件分析ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程及數(shù)據(jù)分析［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2008，26(4):412－428.

［4］ 唐秋艷，王云龍，陳興業(yè).免疫診斷試劑實用技術(shù)［M］.北京:海洋出版社，2009.

［5］ 劉長明，陸月華，張超范，等.豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2005，27(6):479－482.