于 靜，楊承槐，李俊平，李啟紅，劉 丹，夏業(yè)才，蔣桃珍，李慧姣

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病［1］，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化系統(tǒng)等［2］。其特征癥狀為病雞咳嗽、噴嚏、氣管羅音;幼雞流鼻液;蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBV易發(fā)生變異［3］，分型復雜，不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在很大差異［4］。一些毒株用傳統(tǒng)的種毒鑒定方法很難準確鑒別，尤其是血清型相同，但基因型不同的毒株更難鑒別。

IBV M41、H52 和 H120 株均為 M41 血清型［5］。在種毒鑒定、活疫苗鑒別檢驗時均用單特異的M41型高免血清中和后接種雞胚，觀察雞胚是否出現(xiàn)病變，因此無法通過血清中和試驗區(qū)分三個毒株。本研究采用分子生物學技術［6］，對IBV序列中差異較大的序列進行分析，建立了IBV三個毒株的PCR鑒別方法，提高了鑒別特異性。

1 材料與方法

1.1 毒種 IBV種毒株 H52、H120及 M41株，雞傳染性法氏囊病病毒B87、火雞皰疹病毒Fc－126株以及新城疫病病毒La Sota株、雞痘病毒鵪鶉化弱毒株，均由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存。

1.2 試劑 病毒RNA抽提試劑盒、病毒DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品;反轉錄酶系統(tǒng)為Invitrogen公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶NaeⅠ為大連寶生物公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物純化試劑盒為天根生化科技公司產(chǎn)品。

1.3 引物設計

1.3.1 引物A的設計 參照GenBank上發(fā)表的全基因組序列，在序列差異較明顯的2898～4688 bp處設計一對引物:

該引物能從M41株基因組中特異性擴增出長度為1791 bp片斷，而不能擴增H52株和H120株。

1.3.2 引物 B的設計 參照發(fā)表的 H52株和H120株的全基因組序列，設計了一對引物:

該引物能以H52株和H120株為模板特異性擴增長度為1700 bp的目的片度，在H120株擴增片段中含有一個單酶切位點NaeⅠ，而H52擴增片段中無此位點。因此，利用限制性內(nèi)切酶NaeⅠ可以區(qū)分H52株和H120株。

1.4 病毒RNA、DNA的提取 參照OMEGA公司產(chǎn)品說明書，提取病毒RNA和DNA。

1.5 RT －PCR

1.5.1 反轉錄 在20 μL體系中進行，按Invitrogen M－MLV反轉錄酶的說明書進行。

1.5.2 PCR 在25 μL體系中進行。反應管中依次加入 ddH2O 16.3 μL，10 × Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，反轉錄產(chǎn)物2 μL，Ex－Taq 酶 0.2 μL。反應條件為:95 ℃預變性5 min;94℃ 1 min，50.0 ℃(A 引物)或46.3 ℃(B引物)1 min，72℃ 2 min，30個循環(huán);循環(huán)結束后72℃ 延伸10 min。

1.6 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 取適量 PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中90 V穩(wěn)壓電泳25 min，在紫外透射儀上觀察并拍照。

1.7 引物B的PCR擴增產(chǎn)物的酶切 按試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物后，用限制性內(nèi)切酶NaeⅠ進行酶切。

1.8 敏感性鑒定 對IBV種毒H52、H120和M41株種毒分別進行 10 倍倍比稀釋，選取 106.5～100.5EID50/mL七個病毒滴度，用RNA提取試劑盒提取RNA后，用引物A對M41株進行擴增，用引物B對H52株和H120株進行擴增。

1.9 特異性鑒定 用引物A和引物B分別擴增雞傳染性法氏囊病病毒 B87株、火雞皰疹病毒Fc－126株以及新城疫病病毒La Sota株、雞痘病毒鵪鶉化弱毒株，檢測能否擴增出特異性基因片段。

2 結果

2.1 IBV M41株的鑒別檢測 分別以IBV M41、H120和H52株為模板，用引物A進行擴增，M41株得到與預期大小相符的1791 bp片斷，而H52株和H120株未擴增出目的片斷，與預期結果一致(圖1)。

2.2 IBV H120株、H52株的鑒別檢測 分別以IBV H120、H52株為模板，用引物B進行擴增，均擴增到大小為1700 bp的片斷，與預期結果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶NaeⅠ酶切過夜，H52株沒有切開，依然是1700 bp的片斷，而H120株被切成兩個片斷，分別為1000 bp和700 bp，與預期結果相符(圖2)。

2.3 引物特異性 用設計的兩對引物分別對雞傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒以及新城疫病毒等病毒進行擴增，均沒有出現(xiàn)特異性條帶，說明這兩對引物具有良好的特異性。

2.4 引物敏感性 IBV種毒 M41株、H120株和H52株三株種毒分別作10倍倍比稀釋，取106.5～100.5EID50/mL共七個稀釋度，每個稀釋度取160 μL，用于提取RNA，然后用引物A、B進行擴增。結果表明，引物A擴增IBV M41株、引物B擴增IBV H120株和H52株的最低檢測濃度均為103.5EID50/mL，即相當于480個EID50(見圖3－圖5。M:MarkerⅤ;1 ～ 7 依次為:106.5、105.5、104.5、103.5、102.5、101.5、100.5EID50/mL)。

圖3 引物A擴增IBV M41株的敏感性

3 結語

本研究建立的分子鑒別方法具有良好的敏感性和特異性，進一步完善了IBV M41、H52和H120株種毒鑒定、活疫苗鑒別檢驗方法，對疫苗生產(chǎn)、檢驗具有積極意義。

［1］ Saif Y M.禽病學［M］.11版.蘇敬良，譯.北京:北京農(nóng)業(yè)出版社，2005:108－130.

［2］ 王紅寧.禽呼吸系統(tǒng)疾?。跰］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［3］ Ignjatovic J，Gould G，Sapats S，et al.Isolation of a variant infectious bronchitid virus in Australia that further illustrates diversity among emerging strains［J］.Arch Virol，2006，151:1567 －1585.

［4］ Mo Mei－ lan，WEI Zheng － ji，WEI Ping，et al.Isolation and genetic variations of HVRⅠof S gene of infectious bronchitis viruses［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2006，42(8):13－15.

［5］ Koch G，Hartog L，Kant A，et al.Antigenic domains on the peplomer protein of avian infectious bronchitis virus:correlation with biological functions［J］.Gen Virol，1990，71(9):1929 －1935.

［6］ Cavanagh D，Davis P J，Moc－ Kett A P A.Amino acids within hypervariable region 1 of avian coronavirus IBV(Massachusetts serotype)spike glycoprotein are associated with neutralization epitopes［J］.Virus Research，1988，11:141 －150.