張 韌，王建超，陳文慶，劉華杰，高 飛，徐舸辰，林龍飛

(北京清大天一科技有限公司，北京 102200)

在我國(guó)，細(xì)胞反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的研發(fā)和應(yīng)用正成為行業(yè)技術(shù)革新、產(chǎn)業(yè)升級(jí)的重要內(nèi)容。農(nóng)業(yè)部公告第1708號(hào)中明確規(guī)定，自2012年2月1日起，各省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)停止對(duì)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線(xiàn)項(xiàng)目的獸藥GMP驗(yàn)收申請(qǐng)。本文就反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生產(chǎn)中的國(guó)內(nèi)外應(yīng)用和發(fā)展情況進(jìn)行了綜述，分析了動(dòng)物疫苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)和我國(guó)疫苗產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級(jí)所面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

1 反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

口蹄疫被認(rèn)為家畜傳染性疾病中傳染性最強(qiáng)的一種疾病，國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)將之列為A類(lèi)傳染病。2010和2011年，在亞洲、非洲都有口蹄疫局部的爆發(fā)。接種安全、高效的疫苗是預(yù)防口蹄疫疫情發(fā)生的最有效策略之一。通常主要是通過(guò)濃縮技術(shù)提高口蹄疫疫苗的有效抗原量來(lái)實(shí)現(xiàn)其高效性;通過(guò)病毒純化工藝、有效的病毒滅活工藝來(lái)保證疫苗的安全性。反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒能顯著提高口蹄疫病毒抗原濃度。國(guó)際上先進(jìn)的口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝都采用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞技術(shù)、有效的病毒純化工藝及二次病毒滅活工藝。當(dāng)前，面對(duì)國(guó)內(nèi)外嚴(yán)峻的口蹄疫防控形勢(shì)，高質(zhì)量的口蹄疫疫苗必將在口蹄疫防控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.1 國(guó)外應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) BHK21細(xì)胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世紀(jì)60年代，許多國(guó)家實(shí)驗(yàn)室建立起了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK21細(xì)胞繁殖口蹄疫病毒的生產(chǎn)系統(tǒng)［1］。1962年BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)成功，細(xì)胞增殖迅速，并成功應(yīng)用于口蹄疫病毒的生產(chǎn)［2］。反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒也就成為最普遍的口蹄疫疫苗生產(chǎn)方式，主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等國(guó)家［3］(表1)。印度口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)使用8000 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗，南美口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)一般采用3000～5000 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗，口蹄疫病毒抗原146S濃度大約在2 μg/mL。因?yàn)榭谔阋咭呙绫Ｗo(hù)力與146S有正相關(guān)性，這些企業(yè)根據(jù)口蹄疫病毒146S來(lái)配制疫苗有效地保證了疫苗的質(zhì)量。

表1 國(guó)外部分懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗企業(yè)及其生產(chǎn)工藝

但是，這種20世紀(jì)60年代開(kāi)發(fā)的口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝延續(xù)至今，存在許多技術(shù)上的缺陷。國(guó)外口蹄疫疫苗生產(chǎn)使用的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)液是添加磷酸肉湯(Tryptose phosphate broth，TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate，LAH)的 GMEM及EMEM，再補(bǔ)加5% ～10%牛血清(表1)。不同批次間血清質(zhì)量差異引起細(xì)胞培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，導(dǎo)致影響疫苗生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和疫苗質(zhì)量。疫苗中殘留的血清蛋白使接種動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)升高，一定程度上影響疫苗的安全性。在口蹄疫強(qiáng)制免疫的國(guó)家，牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗體的可能性，不僅影響病毒繁殖，而且可能導(dǎo)致口蹄疫病毒在抗體壓力下選擇性變異。牛血清中潛在污染朊病毒或瘋牛病病毒可給動(dòng)物疫苗帶來(lái)潛在的生物危害，TPB或LAH等動(dòng)物來(lái)源成份也存在安全隱患。為提升產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，目前國(guó)外多數(shù)口蹄疫疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家急于將現(xiàn)使用的含血清生產(chǎn)工藝升級(jí)為不含血清生產(chǎn)工藝。

自從20世紀(jì)的80年代起，細(xì)胞培養(yǎng)基(液)發(fā)展迅速，低血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)血清無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分細(xì)胞培養(yǎng)基已商品化，為疫苗生產(chǎn)中少使用或不使用血清奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2 國(guó)內(nèi)應(yīng)用現(xiàn)狀 2008年，默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“清大天一”)在國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)了BHK21低血清細(xì)胞培養(yǎng)基及反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21技術(shù)，并于2009年成功應(yīng)用到國(guó)內(nèi)一家口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)中。使用該工藝生產(chǎn)的口蹄疫抗原146S濃度可以達(dá)到3 μg/mL左右。該工藝全過(guò)程管道化操作，產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，口蹄疫疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量顯著提高，同時(shí)生產(chǎn)成本下降30%［4－8］。

2009年，該公司成功開(kāi)發(fā)了BHK21無(wú)血清無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分培養(yǎng)基和反應(yīng)器無(wú)血清懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞技術(shù)，并2010年成功應(yīng)用到國(guó)內(nèi)某口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)。相比于含血清懸浮培養(yǎng)工藝，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)工藝具有巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。從種子庫(kù)復(fù)蘇BHK21細(xì)胞開(kāi)始，到口蹄疫病毒繁殖、直至收獲的全過(guò)程，不添加任何的血清和動(dòng)物來(lái)源成分，消除了血清抗體對(duì)病毒繁殖的干擾，同時(shí)減輕了純化壓力。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的細(xì)胞密度可以達(dá)到5×106～6×106/mL以上，為生產(chǎn)高濃度口蹄疫疫苗奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

圖1是反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒的工藝流程圖，相比于含血清口蹄疫病毒生產(chǎn)工藝，因?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)，工藝過(guò)程無(wú)需沉降換液。

圖1 4000L反應(yīng)器無(wú)血清懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒工藝流程

目前國(guó)內(nèi)某企業(yè)使用該工藝生產(chǎn)的口蹄疫疫苗正處于報(bào)批階段，其他多家口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)及研究單位也在研發(fā)或?qū)で鬅o(wú)血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗的工藝。

2 反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在禽流感病毒疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

50多年來(lái)，用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗的方法一直沿用至今，基本流程是將新的流感病毒株與適宜雞胚擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株重配，制備并驗(yàn)證疫苗株，隨后進(jìn)行疫苗株的生產(chǎn)條件優(yōu)化和疫苗批量生產(chǎn)，這個(gè)過(guò)程約需要22周以上的時(shí)間［9］。雞胚禽流感工藝簡(jiǎn)單、成熟，但存在缺陷:需要提前準(zhǔn)備高質(zhì)量的受精雞胚，雞胚來(lái)源容易受到禽流感疫情的影響;單個(gè)受精雞胚通常生產(chǎn)一劑疫苗，效率較低，難以在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn);為提高產(chǎn)量，需要進(jìn)行疫苗株馴化過(guò)程［10］。正因如此，著名的市場(chǎng)調(diào)查資訊公司GBI Research在2011年發(fā)表研究報(bào)告指出，采用雞胚生產(chǎn)流感疫苗工藝將逐漸被細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝代替［11］。

采用反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗的過(guò)程大概需要12周時(shí)間［9］，發(fā)生突發(fā)疫情時(shí)，將細(xì)胞庫(kù)中凍存的細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞快速增殖進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn)疫苗，在生物安全三級(jí)環(huán)境下可以直接應(yīng)用野毒流行株進(jìn)行疫苗生產(chǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MDCK、Vero等細(xì)胞對(duì)禽流感或流感病毒敏感，經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，病毒滴度或HA效價(jià)并不低于雞胚。同時(shí)，反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)流感疫苗的安全性和有效性，已有多種流感疫苗被美國(guó)FDA和歐洲EMEA批準(zhǔn)上市(表2)［12－14］。細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)線(xiàn)自動(dòng)化程度高，更容易疫苗的質(zhì)量控制。如，流水線(xiàn)管道化無(wú)菌生產(chǎn)、無(wú)外源因子污染;無(wú)卵清蛋白、易于純化;產(chǎn)品批間差小、純度高、安全性高。

表2 部分利用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)(研究)的企業(yè)

2.1 國(guó)外應(yīng)用現(xiàn)狀 國(guó)際上應(yīng)用反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感病毒生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要有Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞;用反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感病毒主要有PER.C6細(xì)胞、MDCK 33016細(xì)胞和AGE1.CR細(xì)胞。其中，美國(guó)百特生物科技公司(Baxter)的6000 L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗的平臺(tái)是一個(gè)非常成功的案例，能生產(chǎn)人或禽來(lái)源的 H1、H2、H3、H5、H7 和 H9 等各亞型毒株，對(duì)野生型的人H5N1病毒則有更高的生產(chǎn)效率［15］。其工藝流程:復(fù)蘇細(xì)胞庫(kù)的Vero細(xì)胞，經(jīng)方瓶和轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增種子細(xì)胞，接種至生物反應(yīng)器中，經(jīng)過(guò)反應(yīng)器逐級(jí)放大至6000 L反應(yīng)器，控制細(xì)胞密度在2×106～3×106/mL，按一定的病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)接種病毒，病毒吸附l h后加入胰酶，32～35℃孵育48～72 h后收獲病毒液。

2.2 國(guó)內(nèi)應(yīng)用現(xiàn)狀 國(guó)內(nèi)禽流感疫苗或流感疫苗的生產(chǎn)工藝均采用雞胚生產(chǎn)工藝。國(guó)內(nèi)已有多家單位正在開(kāi)發(fā)MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒疫苗工藝。因?yàn)镻ER.C6細(xì)胞、MDCK 33016細(xì)胞和AGE1.CR細(xì)胞都存在專(zhuān)利保護(hù)及許可使用等問(wèn)題，應(yīng)用微載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞成為一種現(xiàn)實(shí)的選擇。但對(duì)于禽流感病毒疫苗，至少1000 L規(guī)模以上的生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)病毒，該禽流感疫苗才有市場(chǎng)價(jià)值。采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗工藝過(guò)程中最大的困難是反應(yīng)器微載體培養(yǎng)細(xì)胞的逐級(jí)放大技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

清大天一自2009年開(kāi)始進(jìn)行反應(yīng)器微載體放大技術(shù)的研發(fā)工作，并于2011年獲得成功，實(shí)現(xiàn)了微載體培養(yǎng)細(xì)胞從10L–50L–120L–650L反應(yīng)器逐級(jí)放大培養(yǎng)MDCK細(xì)胞(圖2)、Vero細(xì)胞以及Marc145細(xì)胞、ST細(xì)胞等。

圖2 10L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞(100×)

篩選具有良好免疫原性又能在動(dòng)物傳代細(xì)胞上繁殖的毒株也是禽流感疫苗生產(chǎn)工藝升級(jí)中的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。國(guó)內(nèi)以高校、生物制品研究所等為首對(duì)該部分有較多的研究。目前，國(guó)內(nèi)禽流感病毒疫苗研究單位與微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞工藝開(kāi)發(fā)企業(yè)進(jìn)行合作，在懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒疫苗的工藝開(kāi)發(fā)中已取得一定成果。同時(shí)清大天一與禽流感疫苗研發(fā)單位進(jìn)行合作，采用cytodex－1微載體培養(yǎng)H5N1禽流感病毒，通過(guò)優(yōu)化工藝，H5N1的血凝(HA)效價(jià)能穩(wěn)定可達(dá)29以上，反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的MDCK在接種H5N1禽流感72 h后的細(xì)胞大部分細(xì)胞已病變、脫落(圖3)。

圖3 感染禽流感病毒72hr的MDCK細(xì)胞(100×)

這些關(guān)鍵工藝技術(shù)的突破將為反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗的產(chǎn)業(yè)化奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

3 展望

從疫苗和懸浮培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等是當(dāng)前世界范圍內(nèi)各大生物公司工業(yè)化生產(chǎn)疫苗的首要選擇。這些工藝技術(shù)的在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用不僅能提高細(xì)胞高密度和疫苗抗原產(chǎn)量，而且規(guī)?；⒆詣?dòng)化的反應(yīng)器疫苗生產(chǎn)平臺(tái)有效保證每批疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。疫苗產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)質(zhì)是不同生物制藥企業(yè)在其核心技術(shù)基礎(chǔ)上的疫苗質(zhì)量之爭(zhēng)，誰(shuí)在未來(lái)掌握了反應(yīng)器疫苗生產(chǎn)工藝技術(shù)以及生產(chǎn)平臺(tái)，提高了效力和安全性等疫苗質(zhì)量，誰(shuí)將會(huì)在下一輪行業(yè)發(fā)展中掌握市場(chǎng)主動(dòng)權(quán)。過(guò)去幾年，我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研發(fā)或生產(chǎn)口蹄疫、禽流感等疫苗方面發(fā)展迅速(表3)，這表明以反應(yīng)器工藝技術(shù)創(chuàng)新為基礎(chǔ)的疫苗質(zhì)量升級(jí)序幕已經(jīng)開(kāi)始。

“建立疫苗和抗體的大規(guī)模和快速反應(yīng)生產(chǎn)新技術(shù)，系統(tǒng)的疫苗效果及質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)體系”是我國(guó)《十二五生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》中的發(fā)展重點(diǎn)之一。反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝技術(shù)的革新是我國(guó)獸用生物制品行業(yè)升級(jí)換代的必然趨勢(shì)?？谔阋?、禽流感等動(dòng)物疫苗生產(chǎn)技術(shù)升級(jí)正是當(dāng)時(shí)，通過(guò)應(yīng)用和發(fā)展反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)，甚至是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗，將不僅能提高我國(guó)疫苗質(zhì)量，有效地發(fā)揮疫苗在我國(guó)防控政策中基礎(chǔ)性作用，而且對(duì)推動(dòng)我國(guó)從疫苗生產(chǎn)大國(guó)走向疫苗生產(chǎn)強(qiáng)國(guó)都有著重要的示范作用和社會(huì)意義。

表3 反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)在我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用概況

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