李啟紅，李俊平，楊承槐，黃建華，蔣桃珍，李慧姣

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為了保證疫苗純凈、安全、有效，活疫苗應(yīng)進(jìn)行外源病毒檢驗?！吨腥A人民共和國獸藥典》(簡稱《獸藥典》)二〇〇五年版中規(guī)定的禽源制品外源病毒檢驗方法有雞胚檢查法、細(xì)胞檢查法和雞檢查法。通常情況下，采用雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行，如果檢驗無結(jié)果或結(jié)果可疑時，用雞檢查法進(jìn)行檢驗［1］。雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法均采用高效價的抗血清中和本病毒后接種雞胚、細(xì)胞，觀察是否有外源病毒引起的病變。采用雞檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗時不需要中和疫苗病毒，但需要接種疫苗的劑量大，即每只雞需接種2次，每次經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼和肌肉注射共接種120羽份。

目前，國內(nèi)使用的鴨瘟活疫苗系用雞胚化的鴨瘟病毒接種SPF雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞，收獲感染的雞胚液、胎兒及絨毛尿囊膜并混合研磨或收獲病毒培養(yǎng)液，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成。在實際檢驗工作中，因抗鴨瘟病毒血清中和效價不高，不能中和《獸藥典》規(guī)定的羽份數(shù)，所以無法通過雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗。選用雞檢查法對鴨瘟活疫苗進(jìn)行外源病毒檢驗時，按《獸藥典》使用1、4月齡的SPF雞接種疫苗后，大部分雞在1周內(nèi)死亡，無法繼續(xù)檢驗。所以，有必要對目前鴨瘟活疫苗的外源病毒檢驗的雞檢查法進(jìn)一步修訂，以便更好地控制疫苗質(zhì)量。本實驗室對實驗用SPF雞的周齡和基礎(chǔ)免疫程序進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物中心。

1.2 鴨瘟種毒 從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心領(lǐng)取種毒，經(jīng)SPF雞胚繁殖，制備的濕毒病毒含量為 107.4ELD50/0.2 mL。

1.3 鴨瘟活疫苗 來自3個企業(yè)5批次。

1.4 抗體檢測ELISA試劑盒 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽呼腸孤病毒(REOV)、雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)、J亞型禽白血病病毒(ALV－J)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)抗體檢測試劑盒，均購自IDEXX公司。

1.5 血凝(HA)抗原 新城疫病毒(NDV)、減蛋綜合征病毒(EDS)HA抗原，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備供應(yīng);H5亞型和H9亞型禽流感病毒(AIV)HA抗原，由國家禽流感參考實驗室制備供應(yīng)。

1.6 方法

1.6.1 建立檢驗方法 SPF雞只周齡、基礎(chǔ)免疫的時間和接種劑量的試驗方案見表1。購進(jìn)4周齡SPF雞后，隔離器分組飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至4、7、9周齡后進(jìn)行試驗。先用小劑量的鴨瘟種毒進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，14 d后再按照《獸藥典》(二〇〇五年版)附錄20頁“雞檢查法”進(jìn)行免疫及抗體檢測。

1.6.2 驗證檢驗方法 按照1.6.1建立的方法，選取5批疫苗樣品進(jìn)行外源病毒檢驗，對所建立方法進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果

2.1 檢驗方法的建立 結(jié)果見表1。選用4周齡SPF雞進(jìn)行鴨瘟活疫苗的外源病毒檢驗時，首次接種 103.0、104.0、105.0ELD50的鴨瘟種毒均引起免疫雞100%發(fā)病，50%以上死亡。7周齡 SPF雞接種103.0ELD50以上的鴨瘟病毒引起25%以上發(fā)病，20% 以上死亡。9 周齡 SPF 雞免疫 102.0、103.0的鴨瘟種毒均未引起臨床癥狀和死亡。

表1 建立檢驗方法的試驗方案及各組發(fā)病和死亡情況

2.2 檢驗方法的驗證 結(jié)果見表2。9、10周齡SPF雞免疫103.0ELD50的鴨瘟種毒均未引起雞只特異性發(fā)病和死亡，基礎(chǔ)免疫后14 d按《獸藥典》(二〇〇五年版)附錄20頁“雞檢查法”規(guī)定的劑量和程序鴨瘟活疫苗，均未出現(xiàn)因疫苗引起的異常臨床癥狀和特異性死亡。

表2 驗證檢驗方法的試驗方案及各組雞發(fā)病死亡情況

2.3 抗體檢測結(jié)果 見表3。選取建立方法試驗的第6組(免疫劑量最大)、檢驗方法驗證試驗的5批疫苗及對照組雞的血清樣品，按《獸藥典》(二〇〇五年版)檢測11種(亞型)病原抗體，結(jié)果C和E 2批次疫苗中污染REV(抗體陽性率為47%和60%，S/P 比值為0.60 ～8.1 和0.69 ～7.48)，說明目前我國鴨瘟活疫苗中有污染外源病毒的現(xiàn)象。

表3 抗體檢測結(jié)果

3 討論

目前國內(nèi)使用的鴨瘟活疫苗種毒為1957年分離自發(fā)病鴨的強(qiáng)毒株［2］，經(jīng)雞胚連續(xù)傳代60多代后獲得，對鴨失去致病性，但保留了良好的免疫原性［3］。雞非鴨瘟病毒的自然易感宿主［4］，但經(jīng)雞胚連續(xù)傳代的鴨瘟病毒可在雞胚上增殖，其可以獲得高滴度的病毒，同時也可增強(qiáng)對雞的致病性。早在1981年，黃如意等研究人員就報道了鴨瘟活疫苗能致雛雞發(fā)病、死亡［5］。

外源病毒檢驗是獸用活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的關(guān)鍵項之一，有效控制外源病毒污染關(guān)系到疫苗使用的安全性和有效性，直接影響疫病防控效果和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，以及動物源性食品安全。有關(guān)外源病毒檢驗，《歐洲藥典》［6］、美國的《聯(lián)邦法規(guī)》(9CFR)［7］均有嚴(yán)格的規(guī)定和原則要求，我國《獸藥典》有關(guān)規(guī)定和要求與歐美相似，外源病毒檢驗方法參考國外的方法建立，并逐步完善。

我國是養(yǎng)鴨大國，鴨的養(yǎng)殖量占全球的60%以上，用于預(yù)防鴨病的生物制品品種相對較多，用量大。國外鴨的養(yǎng)殖量少，用于預(yù)防鴨病的活疫苗品種也少，鮮見鴨用活疫苗外源病毒檢驗的具體方法。鴨瘟活疫苗外源病毒檢驗按照我國原有《獸藥典》的有關(guān)規(guī)定無法進(jìn)行，參照《歐洲藥典》有關(guān)水禽活疫苗種毒外源病毒雞檢查法的原則，研究建立用雞檢查法對鴨瘟活疫苗進(jìn)行外源病毒檢驗的切實可行的方法。

本研究證實，9周齡以下的 SPF雞接種103.0ELD50的鴨瘟活疫苗可引起嚴(yán)重的發(fā)病和死亡，發(fā)病及死亡率隨著接種劑量增加有升高的趨勢，隨著接種雞日齡的提大，發(fā)病率和死亡率明顯下降，9周齡和10周齡SPF雞免疫103.0ELD50的鴨瘟活疫苗病毒后均無臨床癥狀和特意死亡。根據(jù)試驗結(jié)果，為保證外源病毒檢驗時免疫雞不發(fā)病，選擇9～12周齡的SPF雞用于檢驗。在按藥典規(guī)定劑量免疫前，先用低劑量鴨瘟病毒進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，從而建立了鴨瘟活疫苗的外源病毒檢驗的雞檢查法，該方法已被《獸藥典》(二〇一〇年版)［8］收錄。

應(yīng)用建立的檢驗方法，對3個企業(yè)5批次的鴨瘟活疫苗進(jìn)行了外源病毒檢驗，同時選取建立方法試驗時的第6組(免疫劑量最大)進(jìn)行抗體檢測。結(jié)果表明，用于基礎(chǔ)免疫的鴨瘟種毒無外源病毒污染，2批次疫苗中污染了REV，說明目前我國鴨瘟活疫苗中有污染外源病毒的現(xiàn)象，有必要加強(qiáng)對鴨瘟活疫苗的監(jiān)督檢驗。

致謝 感謝中國獸藥典委員會對本研究的資助。感謝瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司在動物實驗過程中給予的大力幫助。

［1］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版三部［S］.

［2］ 黃引賢.擬鴨瘟的研究［J］.華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1959，1:67 －78.

［3］ 農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000年版［S］.

［4］ Saif Y M.Disease of Poultry［S］.12thEdition.USA:Blackwell Publshing，2008.

［5］ 黃如意，肖俊發(fā)，陳荷鳳，等.鴨瘟弱毒疫苗對雞致死研究初報［J］.上海農(nóng)業(yè)科技，1981，2:37，34.

［6］ Council of Europe.European Pharmacopoeia［S］.6thEdition.Section 2.6.24;Revised 2008.

［7］ Office of the Federal Register National Archives and Records Administration.Code of Federal Regulations(9 Animal and Animal Products)［S］.USA:US Government Pringting Officeh，2007.

［8］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部［S］.