胡剛?cè)~，萇生科，莊金山，白朝勇，張?jiān)S科，

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病與微生物實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002;2.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng) 471000)

豬瘟病毒(CSFV)的E2基因編碼的蛋白是引起動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的主要抗原蛋白［1］。目前已被批準(zhǔn)生產(chǎn)的豬瘟標(biāo)記疫苗是Advasure?(Pfizer，UK)和 Porcilis Pesti? (Intervet，the Netherlands)［2］，二者均是以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的亞單位疫苗，可以很容易通過(guò)檢測(cè)其它相關(guān)抗體來(lái)區(qū)別免疫豬和感染豬。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠有效進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工，如轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、糖基化、脂?；?，其表達(dá)的外源蛋白結(jié)構(gòu)與天然蛋白結(jié)構(gòu)非常接近。近年來(lái)，通過(guò)家蠶幼蟲(chóng)和蠶蛹感染重組桿狀病毒表達(dá)外源蛋白的方法成功地應(yīng)用于一些蛋白的表達(dá)，外源蛋白的表達(dá)量得到大幅提高。周耐明等［3］利用重組的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)在家蠶幼蟲(chóng)和蠶蛹中高效表達(dá)了具有生理活性的 HBsAg，表達(dá)量高達(dá)750 μg/蠶。肖慶利等［4］利用重組的BmNPV在家蠶幼蟲(chóng)中高效表達(dá)了禽馬立克氏病毒糖蛋白B抗原，每1 mL蠶血淋巴表達(dá)量可達(dá)1 mg。

本文利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了含有CSFV E2基因的重組AcNPV。重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后通過(guò)分泌途徑產(chǎn)生重組CSFV E2蛋白，在家蠶蛹中亦成功表達(dá)出CSFV E2蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 豬瘟活疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司(生產(chǎn)批號(hào):2010005);AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)試劑盒、pFastBacHBM-TOPO載體、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞均為Invitrogen公司產(chǎn)品;Sf9細(xì)胞由國(guó)家獸藥工程技術(shù)研究中心保存;QIAamp Viral RNAMini Kit由QIAgen公司生產(chǎn);小量質(zhì)粒提取試劑盒、小量膠回收試劑盒均由天根生化科技有限公司生產(chǎn);AMV反轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、RNA酶抑制劑、T4 DNA連接酶等均由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn);DAB顯色試劑盒由康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn);CSFV陽(yáng)性豬血清由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供;5日齡蠶(品種為大造)由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。

1.2 引物 根據(jù)GenBank登錄的豬瘟病毒C-株的cDNA序列(HM175885)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物用于擴(kuò)增豬瘟E2基因。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成，其序列如下:

其中引物C6EU的5’端引入了BamH I位點(diǎn)，引物C6ED引入了Hind III位點(diǎn)。

根據(jù)設(shè)計(jì)，EHU/EHD引物對(duì)理論上應(yīng)擴(kuò)增出豬瘟病毒E2基因大小為1026 bp;C6EU/C6ED引物對(duì)理論上應(yīng)擴(kuò)增出豬瘟病毒E2基因大小為1113 bp，該引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物包含豬瘟病毒E2基因5’端的內(nèi)源性信號(hào)肽序列，加上引物上的酶切位點(diǎn)及末端序列后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)為1133 bp。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增目的基因 將豬瘟活疫苗用稀釋液稀釋后，按照QIAamp Viral RNAMini Kit說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行豬瘟病毒RNA的制備，然后分別利用引物EHD和引物C6ED做為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA的制備。反轉(zhuǎn)錄體系如下:病毒RNA 10.5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物(10 pmol/L)1 μL，RNA 酶抑制劑0.5 μL，dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)，反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL(5 U)，反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer 4 μL，總體系為 20 μL，在PCR儀中進(jìn)行42℃作用1 h。然后在進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR 反應(yīng)總體系為 50 μL:cDNA 模板 3 μL，上下游引物各(10 pmol/L)1 μL，dNTP 4 μL(2.5 mmol/L)，高保真 DNA聚合酶 1 μL，高保真 DNA聚合酶 Buffer 5 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。引物對(duì)EHU/EHD的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為PCR-E2。C6EU/C6ED引物對(duì)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物命名為PCR-C6E2。擴(kuò)增完成后，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果大小與目的基因大小一致時(shí)，切膠，按照膠回收試劑盒步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。

1.4 重組桿狀病毒的獲得 按照AcNPV Bacto-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)步驟，將引物對(duì)EHU/EHD擴(kuò)增的產(chǎn)物PCR-E2直接克隆入pFastBacHBM-TOPO載體中，克隆產(chǎn)物命名為pFast-E2;將引物對(duì)C6EU/C6ED擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物PCR-C6E2通過(guò) BamH I和 Hind III克隆入pFastBacI中，克隆產(chǎn)物命名為 pFast-C6E2。然后，將重組供體質(zhì)粒pFast-E2和pFast-C6E2分別轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性重組的桿狀病毒基因組質(zhì)粒(Bacmid)，并分別命名為Bacmid-E2和Bacmid-C6E2，然后將Bacmid-E2和Bacmid-C6E2轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，同時(shí)也將Bacmid空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞做為對(duì)照病毒。轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞，待50%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲培養(yǎng)上清，通過(guò)AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)試劑盒中提供的引物對(duì)M13F/M13R擴(kuò)增特異性片段鑒定重組病毒，重組病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)約為2300 bp加上目的基因的大小，不含有目的基因的對(duì)照病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為300 bp。PCR反應(yīng)總體系為50 μL:病毒基因組模板 3 μL，M13F/M13R(10 pmol/L)各 1 μL，dNTP 4 μL(2.5 mmol/L)，高保真 DNA 聚合酶 1 μL，高保真 DNA聚合酶 Buffer 5 μL，用 ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 5 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。獲得的重組病毒分別命名為VBac-E2和VBac-C6E2，對(duì)照病毒命名為VBac。

1.5 重組病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)CSFV E2的鑒定間接免疫熒光鑒定重組蛋白:以M.O.I.=10感染生長(zhǎng)至80%左右的單層Sf9細(xì)胞，感染48 h后用PBS(0.01 mol/L pH7.4)洗滌細(xì)胞 3 次，冷甲醇固定10 min，用含有1%BSA的PBS封閉30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，加入CSFV陽(yáng)性豬血清于37℃溫箱孵育1 h，再用PBS洗滌3次，每次5 min，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗豬 IgG二抗37℃孵育45 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min，然后置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

ELISA法鑒定重組蛋白:按照韓國(guó)金諾公司豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以M.O.I.=10感染生長(zhǎng)至80%左右的單層Sf9細(xì)胞，感染后48、60、72和84 h分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的重組蛋白。

1.6 重組蛋白在家蠶蠶蛹中表達(dá) 將獲得的轉(zhuǎn)蛹3 d后的蠶蛹通過(guò)微量注射器進(jìn)行蠶蛹體節(jié)之間皮下注射，挑選40只蠶蛹進(jìn)行隨機(jī)分成5組，第1組5只蠶蛹，每只注射0.01 mol/L的pH6.4的 PBS 2.5 μL，做為 PBS對(duì)照組;第 2 組 10 只蠶蛹，每只注射2.5 μL 濃度為 2.5 ×105PFU/μL 的 VBac-E2重組病毒液;第3組10只蠶蛹，每只注射2.5 μL濃度為2.5×105PFU/μL的 VBac-C6E2重組病毒液;第4組10只蠶蛹，每只注射2.5 μL濃度為2.5×105PFU/μL的VBac對(duì)照病毒液;第5組5只蠶蛹，不注射，做為空白對(duì)照組。注射后第7天收獲蠶蛹血淋巴，凍存于-20℃，備用。

1.7 Western-blot鑒定蠶蛹血淋巴中重組蛋白的表達(dá) 將收集的蠶蛹血淋巴進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將膠塊上的蛋白條帶經(jīng)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉過(guò)夜，以CSFV陽(yáng)性豬血清作為一抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5 min，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG作為二抗，37℃孵育1 h，然后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，并進(jìn)行拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增目的基因 RT-PCR產(chǎn)物PCR-E2和PCR-C6E2通過(guò)核酸凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，獲得了與預(yù)期大小一致的DNA條帶(1026 bp和1133 bp)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增目的基因

2.2 重組桿狀病毒的鑒定 將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-E2、Bacmid-C6E2和Bacmid空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)染后72～96 h觀察到三種桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變。通過(guò)引物對(duì)M13F/M13R對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果(圖2)顯示重組病毒構(gòu)建成功。

圖2 重組桿狀病毒的鑒定

2.3 重組病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)CSFV E2的鑒定間接免疫熒光鑒定重組病毒在感染后48 h后的Sf9細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)情況。在VBac-E2和VBac-C6E2感染的Sf9細(xì)胞中能觀察到熒光，而VBac感染的Sf9細(xì)胞中沒(méi)有觀察到熒光，結(jié)果表明，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2感染Sf9細(xì)胞后均能夠表達(dá)CSFV E2蛋白。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白是否能分泌表達(dá)，對(duì)感染Sf9細(xì)胞48、60、72和84 h后的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，樣品在450 nm波長(zhǎng)下的OD值結(jié)果如表1。

根據(jù)試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)樣品OD值≥0.4375時(shí)應(yīng)判定為陽(yáng)性，表1中結(jié)果顯示，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2在感染Sf9細(xì)胞后48、60、72和84 h的細(xì)胞上清中重組蛋白檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)照病毒VBac感染Sf9細(xì)胞84 h后細(xì)胞上清中重組蛋白檢測(cè)結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2在感染Sf9細(xì)胞后能夠分泌表達(dá)CSFV E2蛋白。

表1 重組蛋白的ELISA檢測(cè)

2.4 重組蛋白在家蠶蠶蛹中表達(dá)及Western-blot鑒定 按照材料與方法1.6中所述進(jìn)行蠶蛹注射重組病毒，在注射后發(fā)現(xiàn)注射重組病毒及對(duì)照病毒的蠶蛹的體色變暗甚至發(fā)黑，而PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組則體色變化較小或無(wú)變化。于注射后第7天收獲蠶蛹血淋巴進(jìn)行Western-blot鑒定重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2注射蠶蛹組血淋巴在45～60 kD之間，靠近45 kD條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符(約48 kD)。

圖3 Western-blot鑒定蠶蛹中重組蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究構(gòu)建了兩株重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2。其中，在 VBac-E2中 CSFV E2基因通過(guò)供體質(zhì)粒pFastBacHBM-TOPO載體而引入了蜂毒素信號(hào)肽序列，目的想通過(guò)蜂毒素信號(hào)肽的引導(dǎo)來(lái)分泌表達(dá)CSFV E2蛋白。研究結(jié)果表明，蜂毒素信號(hào)肽能夠引導(dǎo)CSFV E2的分泌表達(dá)。重組病毒VBac-C6E2中，目的基因5’端存在CSFV的內(nèi)源信號(hào)肽序列，試驗(yàn)表明內(nèi)源性信號(hào)肽同樣能夠引導(dǎo)CSFV E2的分泌表達(dá)。

有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為AcNPV經(jīng)口或皮下注射不感染家蠶［5-6］，但也有報(bào)道稱AcNPV能感染特殊品種的家蠶［7-8］。本研究通過(guò)注射感染大造蠶蛹進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，Western-blot分析結(jié)果表明重組AcNPV能夠在大造蠶蛹中表達(dá)CSFV E2蛋白。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行外源蛋白表達(dá)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄翻譯和翻譯后修飾加工等與動(dòng)物細(xì)胞相似，表達(dá)的外源蛋白活性與天然蛋白基本一致［9］。而家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)重組蛋白，外源蛋白的表達(dá)量和生物活性更好，成本更低［10］。與傳統(tǒng)重組BmNPV的構(gòu)建相比，重組AcNPV的構(gòu)建操作更簡(jiǎn)單，技術(shù)更成熟。家蠶并非AcNPV的天然宿主，通過(guò)注射感染家蠶蛹的癥狀更輕微，不易造成致死性的病理變化，可能更有利于家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)重組蛋白的應(yīng)用。利用引物對(duì)M13F/M13R對(duì)重組病毒進(jìn)行鑒定時(shí)，在預(yù)期大小位置處出現(xiàn)了特異性條帶，但也存在一些非預(yù)期大小的條帶，這可能是由于PCR擴(kuò)增時(shí)較低的退火溫度所致，也可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在較多的雜蛋白，引起引物非特異性結(jié)合所致。

雖然，本研究利用重組AcNPV在蠶蛹中成功表達(dá)了CSFV E2蛋白，但蠶蛹感染重組病毒的方式、重組病毒的感染劑量、重組蛋白的純化工藝、表達(dá)量?jī)?yōu)化等一些問(wèn)題還有待于深入研究。

［1］ Risatti G R，Borca M V，Kutish G F，et al.The E2 glycoprotein of classical swine fever virus is a virulence determinant in swine［J］.J Virol，2005，79(6):3787-3796.

［2］ Blome S，Meindl-B?hmer A，Loeffen W，et al.Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccine performance［J］.Rev Sci Tech Off Int Epiz，2006，25(3):1025-1038.

［3］ 周耐明，張 穎，金 偉，等.乙肝病毒S基因在家蠶細(xì)胞及蠶體內(nèi)高效表達(dá)狀［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1995，32(11):111-115.

［4］ 肖慶利，季 平，何家祿，等.禽馬立克氏病毒糖蛋白B基因在家蠶中的表達(dá)［J］.蠶業(yè)科學(xué)，1997，23(2):104-108.

［5］ Shikata M，Shibata H，Sakurai M，et al.The ecdysteroid UDP-glucosyltransferase gene of Autographa californica nucleopolyhedrovirus alters the moulting and metamorphosis of a non-target insect，the silkworm，Bombyx mori Lepidoptera，Bombycidae［J］.J Gen Virol，1998，79:1547-1551.

［6］ Yamao M，Katayama N，Nakazawa H，et al.Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus［J］.Genes Dev，1999，13:511-516.

［7］ Tingqing Guo，Shengpeng Wang，Xiuyang Guo，et al.Productive infection of Autographa californica nucleopolyhedrovirus in silkworm Bombyx mori strain Haoyue due to the absence of a host antiviral factor［J］.Virology，2005，341:231-237.

［8］ T Q Guo，J Y Wang，X Y Guo，et al.Transient in vivo gene delivery to the silkworm Bombyx mori by EGT-null recombinant AcNPV using EGFP as a reporter［J］.Archives of Virology，2005，150:93-105.

［9］ 吳小鋒，岳萬(wàn)福，劉劍梅，等.Bac-to-Bac系統(tǒng)的研究進(jìn)展及在家蠶中的應(yīng)用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33(1):146-150.

［10］楊瑞麗，金勇豐，吳玉澄，等.利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用蛋白的研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2001，27(2):173-178.