王 君 鄭 紡 王寶利

核因子κB受體活化因子配基（RANKL）與其靶信號受體核因子κB受體活化因子（RANK）及誘餌受體護骨素（OPG）是調(diào)控骨吸收最重要的細(xì)胞因子系統(tǒng)[1-2]，是其他多數(shù)骨吸收調(diào)控因子的媒介[3]。破骨細(xì)胞分化抑制因子 （osteoclast inhibitory lectin,OCIL）是近年來新克隆的Ⅱ類跨膜C型凝集素，其組織分布與RANKL/OPG系統(tǒng)相似[4-5]。體外研究表明OCIL直接抑制小鼠黏附性脾細(xì)胞向破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化，提示破骨細(xì)胞前體上可能存在著OCIL受體，OCIL可以直接作用于該受體而影響破骨細(xì)胞分化[4]。但本研究小組前期研究顯示，OCIL的抗破骨細(xì)胞生成作用與其影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞RANKL/OPG系統(tǒng)的表達(dá)有關(guān)[6]。本研究旨在探討成骨細(xì)胞中OCIL基因表達(dá)下調(diào)后骨吸收相關(guān)基因OPG和RANKL mRNA表達(dá)水平的變化，以及其對破骨細(xì)胞生成的影響。

Table 1 shRNA coding sequences of rat OCIL mRNA表1 大鼠OCIL mRNA的shRNA寡核苷酸序列

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 大鼠UMR106細(xì)胞株為本室保存。小干擾表達(dá)載體pRNATU6.1/Neo（GenScript公司）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000、G418（美國 Invitrogen公司），MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （Promega公司），SYBR誖Green Master Mix（TOYOBO 公司），TRI試劑（Molecular Research Center）。質(zhì)粒高純度提取試劑盒購自天根生物有限公司，甲狀旁腺素（PTH）購自北京康肽生物技術(shù)公司，寡核苷酸合成和DNA序列分析由上海英駿生物技術(shù)公司完成。實時熒光PCR分析在羅氏LightCycler 2.0熒光定量PCR系統(tǒng)上進行。

1.2 方法

1.2.1 OCIL shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 使用GenScript公司網(wǎng)站提供的siRNA Target Finder和siRNA Construct Builder（http://www.genscript.com/rnai.html）軟件設(shè)計針對大鼠OCIL mRNA的 233、914、1301位點的 3對siRNA編碼序列，在序列兩端加上限制性內(nèi)切酶酶切位點Bam HⅠ和HindⅢ的切割后末端及10 bp環(huán)狀的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)序列，分別命名為N1、N2和N3，見表1。采用本研究前期方法[7]將N1、N2和N3的序列分別通過Bam HⅠ和HindⅢ位點克隆于pRNATU6.1/Neo載體。使用Eco RⅠ和Eco RⅤ雙酶切及序列分析鑒定重組陽性克隆的正確性。將構(gòu)建成功的OCIL特異性shRNA表達(dá)載體分別命名為pRNAT-N1、pRNAT-N2和pRNAT-N3。

1.2.2 shRNA表達(dá)載體干擾OCIL mRNA表達(dá)效果的鑒定 將對數(shù)生長期的UMR106細(xì)胞按2×105/孔接種至6孔板并隨機分為4組，使用Lipofectamine 2000分別將0.8μg的 pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3和對照載體 pRNATU6.1/Neo/CTL（陰性對照轉(zhuǎn)染組，該載體包含一段不編碼任何大鼠基因mRNA的陰性對照序列）轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞內(nèi)。使用400 mg/L的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)各shRNA表達(dá)載體和pRNAT-U6.1/Neo/CTL的UMR106細(xì)胞株。采用TRI試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈，Real-time PCR檢測OCIL和β-actin mRNA水平，以β-actin校對后的OCIL水平代表OCIL相對表達(dá)水平。以各重組載體組OCIL mRNA相對水平與對照載體組OCIL mRNA相對表達(dá)水平的比值來表示抑制率。篩選出對OCIL mRNA干擾效果最佳的shRNA表達(dá)載體，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 OCIL shRNA表達(dá)載體對UMR106細(xì)胞中OPG和RANKL mRNA表達(dá)的影響 將對OCIL mRNA干擾效果最佳的shRNA表達(dá)載體（pRNAT-N1組）和對照載體pRNATU6.1/Neo/CTL（control組）分別瞬時轉(zhuǎn)染UMR106細(xì)胞，12和24 h后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈，Real-time PCR檢測OPG和RANKL mRNA的表達(dá)。PCR引物序列，見表2。PCR 反應(yīng)條件：（1）25 μL 反應(yīng)體系。上、下游引物 10μmol/L 各 1μL，cDNA 模板 5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 12.5 μL，dd H2O 5.3 μL。（2）循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s， 進行 40 個循環(huán)。采用相對定量法來評價目的基因mRNA的表達(dá)水平，管家基因β-actin被用來標(biāo)準(zhǔn)化樣品。

1.2.4 OCIL基因敲減的成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞樣細(xì)胞（osteoclast-like cell,OLC）生成的影響 按文獻[8]所述方法分離大鼠骨髓細(xì)胞，稀釋至5×106/mL，加入20μg/L的巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （M-CSF），將細(xì)胞懸液加入96孔板，0.1 mL/孔。細(xì)胞分為3組，vehicle組加入PBS及前述control shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h的條件培養(yǎng)基 （占總體積10%）；PTH組加入1×10-7mol/L PTH及control shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h的條件培養(yǎng)基；shRNA組加入 1×10-7mol/L PTH及 OCIL shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h的條件培養(yǎng)基 （PTH+OCIL shRNA），37℃，5%CO2培養(yǎng)。3 d后換液并維持藥物濃度不變。每天觀察OLC分化情況。第7天進行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色，計數(shù)OLC個數(shù)。細(xì)胞核數(shù)目≥3的細(xì)胞認(rèn)定為OLC。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件完成。計量數(shù)據(jù)以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Table 2 Real-time PCR primers表2 Real-time PCR引物

2 結(jié)果

2.1 OCIL特異性shRNA重組表達(dá)載體的酶切鑒定和DNA序列分析 隨機抽取pRNAT-N1、pRNAT-N2和pRNAT-N3各3個重組陽性克隆分別行Eco RⅠ和Eco RⅤ雙酶切鑒定和1.5%瓊脂糖凝膠電泳，3者雙酶切后得到的小片段長度均約370 bp，見圖1。重組陽性克隆經(jīng)序列測定證明插入序列正確。

2.2 3種shRNA重組表達(dá)載體干擾OCIL mRNA表達(dá)的效果鑒定 與陰性對照轉(zhuǎn)染組比較，3種shRNA表達(dá)載體對OCIL mRNA的表達(dá)均有沉默作用，pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3 OCIL mRNA相對表達(dá)水平分別為0.36±0.08、0.72±0.12 及0.41±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.24，P<0.05），各組兩兩比較顯示，除pRNAT-N1和pRNAT-N3組（P=0.266）外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3對OCIL mRNA水平的抑制率分別為64%、28%和59%。

2.3 pRNAT-N1轉(zhuǎn)染的UMR106細(xì)胞中OPG和RANKL mRNA的表達(dá) pRNAT-N1組 12、24 h RANKL mRNA表達(dá)水平較control組均升高，而OPG mRNA的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。pRNAT-N1 組 RANKL∶OPG 比值在 12 h和24 h分別為對照組的2.9倍和5.1倍，見表3。

Figure 1 Digestion of pRNAT-N1,pRNAT-N2 and pRNAT-N3 constructs圖1 pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3 的酶切鑒定

Table 3 The mRNA expression of RANKL and OPG in UMR106 cells transfected with pRNAT-N1表3 pRNAT-N1轉(zhuǎn)染的UMR106細(xì)胞中RANKL和OPG mRNA的表達(dá) （±s）

Table 3 The mRNA expression of RANKL and OPG in UMR106 cells transfected with pRNAT-N1表3 pRNAT-N1轉(zhuǎn)染的UMR106細(xì)胞中RANKL和OPG mRNA的表達(dá) （±s）

**P<0.01

?

2.4 OCIL基因敲減的成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞樣細(xì)胞生成的影響 Vehicle組、PTH組及shRNA組OLC數(shù)分別為（1.83±0.75）個/孔、（49.67±6.77）個/孔及（65.50±7.34）個/孔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=197.108，P<0.05）。

3 討論

OCIL是Zhou等[4]在小鼠成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，屬于Ⅱ型跨膜C型凝集素，并且該研究認(rèn)為OCIL可能是獨立于RANKL/OPG系統(tǒng)外的、調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)育和骨吸收的又一條作用通路。筆者曾采用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組OCIL的方法，證實重組OCIL顯著抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL表達(dá)而上調(diào)OPG表達(dá)，與其他多數(shù)骨吸收調(diào)節(jié)因子相似，OCIL也可通過影響RANKL/OPG系統(tǒng)表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞分化[6]。Nakamura等[9]研究顯示，成骨細(xì)胞上存在著OCIL的受體，OCIL可以通過成骨細(xì)胞之間的相互接觸溝通調(diào)節(jié)彼此的分化和其他細(xì)胞生物行為。本研究pRNAT-N1組12、24 h的RANKL mRNA表達(dá)水平較control組均升高，而OPG mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RANKL∶OPG比值變化顯著，表明OCIL可以通過位于成骨細(xì)胞的受體而調(diào)節(jié)RANKL/OPG表達(dá)。

本研究中vehicle組、PTH組及shRNA組OLC生成差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明成骨細(xì)胞OCIL表達(dá)減低后對破骨細(xì)胞分化的支持作用加強。OCIL是一種跨膜糖蛋白，由于本研究采用的是OCIL shRNA轉(zhuǎn)染的成骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，它對破骨細(xì)胞的影響不是OCIL的直接作用，而與培養(yǎng)基中的RANKL/OPG相對表達(dá)改變有關(guān)，進一步提示在OCIL對破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用中有RANKL/OPG系統(tǒng)的參與。因此，OCIL可能通過直接和間接兩種方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。本研究與相關(guān)研究結(jié)論不同[4,9]，原因可能為：（1）所采用的細(xì)胞體系不同。Zhou等[4]在研究重組OCIL功能時采用小鼠黏附性脾細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化。由于這一培養(yǎng)體系中缺少成骨細(xì)胞，OPG的表達(dá)水平很低。Nakamura等[9]則在研究重組OCIL調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的研究中采用了使用并不廣泛的KUSAO成骨細(xì)胞系。筆者前期在探討OCIL生物活性時采用了小鼠骨髓細(xì)胞，它屬于混合細(xì)胞體系，含有成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等多種細(xì)胞前體[8]。本研究中筆者采用了較為常用的UMR106成骨細(xì)胞。（2）所采用的重組OCIL蛋白來源不同。文獻[4,9]采用了產(chǎn)自原核細(xì)胞的重組OCIL，缺少糖基化等化學(xué)修飾，而本研究采用的OCIL蛋白來源于哺乳動物細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞，可能具備更完整的生物學(xué)活性。

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