劉丹尹東孫惦許旻何明

脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能激發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生膿毒血癥[1]。心臟是膿毒血癥中最易受損的主要靶器官之一[2]，因此，為降低膿毒血癥的病死率，減輕心臟功能損傷極為重要。本課題組前期在內(nèi)毒素整體動(dòng)物模型上觀察到，內(nèi)毒素血癥時(shí)心肌14-3-3γ表達(dá)增加，提示14-3-3γ可能在內(nèi)毒素所致的心肌損傷中發(fā)揮重要作用[3]。本研究擬構(gòu)建pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，旨在從細(xì)胞水平探討其在心肌細(xì)胞損傷中的作用，并進(jìn)一步檢測(cè)凋亡的重要調(diào)節(jié)因子Bax的表達(dá)與分布，深入探討14-3-3γ的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 受試藥品與主要試劑 pFLAG-CMVTM-4質(zhì)粒（Sigma公司），限制性內(nèi)切酶 Eco RⅠ和 KpnⅠ（NEB），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒 （Promega 公司），14-3-3γ 抗體、Bax抗體、β-actin 抗體及相應(yīng)二抗 （Santa Cruz），線粒體分離試劑盒 （Biovision公司），LipofectamineTM2000 （Invitrogen），MEM 培養(yǎng)基（GIBCO BRL公司產(chǎn)品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光印跡試劑和硝酸纖維素膜（Amersham公司），胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素,丙烯酰胺、SDS，亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、EDTA和 DTT（Sigma公司產(chǎn)品），其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[4]方法略加改進(jìn)，以下操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。取出生1～3 d的SD乳鼠，開胸取出心臟，分離心室組織，經(jīng)0.1%胰酶消化分離，用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）培養(yǎng)2 h去除成纖維細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)鑒別細(xì)胞存活率在90%以上者用于實(shí)驗(yàn)，然后按5×105/孔、1×104/孔分別接種于6孔培養(yǎng)板和96孔培養(yǎng)板內(nèi)，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （Brdu）抑制纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)4 d隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組（1）對(duì)照（Control）組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及未經(jīng)LPS處理組。（2）LPS組：加LPS至培養(yǎng)液中，終濃度為10 mg/L，孵育6 h。（3）pFLAG+LPS組：空載質(zhì)粒pFLAG轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，24 h 后處理同 LPS 組。（4）pFLAG-14-3-3γ+LPS 組：重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，24 h后處理同LPS組。

1.2.3 14-3-3γ真核表達(dá)載體pFLAG-14-3-3γ的構(gòu)建 取SD鼠心肌組織 50 mg，用 RT-PCR方法獲取 14-3-3γ（GenBank D17447.1）的全長(zhǎng)編碼 cDNA，引物序列 上游：5′-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3′， 下游：5′-TTAGGTACCTG GGGCCTTAGTTGTT-3′，分別在上、下游引物中引入 Eco RⅠ和KpnⅠ的酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。PCR擴(kuò)增后的目的基因cDNA與質(zhì)粒pFLAG-CMVTM-4用 Eco RⅠ和 KpnⅠ雙酶切、T4連接酶連接。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并用抗生素篩選。質(zhì)粒提取后，行酶切鑒定和DNA測(cè)序。

1.2.4 pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率的檢測(cè) 在轉(zhuǎn)染前，PBS洗2次，除去抗生素，將 LipofectamineTM2000（μL）與 DNA（μL）以 2.0∶0.8 比例混合，加入到每孔細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中孵育。24h后裂解細(xì)胞，提取蛋白，Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞14-3-3γ蛋白表達(dá)。以空載質(zhì)粒載體pFLAG為對(duì)照。

1.2.5 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)。胰酶消化后收集細(xì)胞，每組細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%～80%后吸出培養(yǎng)基。每孔加入MTT溶液（5 g/L溶于PBS）20μL，37℃孵育4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，再每孔加DMSO 150μL振蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度（OD）值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 生化檢測(cè) 各組分別取孵育液200μL，美國(guó)Beckman生化自動(dòng)分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸酶（CPK）活性。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，LDH及CPK會(huì)釋放至孵育液中，使得LDH及CPK值升高，故LDH、CPK值與心肌細(xì)胞損傷成正比。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入300μL Binding buffer，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)線粒體和胞漿中Bax蛋白水平 各組使用線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒，按操作說(shuō)明書制備線粒體和胞漿蛋白。同等量蛋白質(zhì)完成SDS-PAGE后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，再先后結(jié)合一抗和二抗，最后X線膠片曝光分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ對(duì)心肌細(xì)胞14-3-3γ蛋白表達(dá)的影響 pFLAG組的14-3-3γ蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯升高，pFLAG-14-3-3γ組的14-3-3γ蛋白表達(dá)高于對(duì)照組和pFLAG組 （P<0.001）。說(shuō)明重組14-3-3γ的真核表達(dá)載體在原代乳鼠心肌細(xì)胞中能有效表達(dá)，見圖1、表1。

Figure 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups圖1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達(dá)

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達(dá) （n=6，±s）

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達(dá) （n=6，±s）

**P<0.01

?

2.2 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對(duì)LPS損傷后細(xì)胞存活率的影響 LPS組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.001）；而轉(zhuǎn)染了pFLAG-14-3-3γ的心肌細(xì)胞能明顯對(duì)抗隨后LPS所致?lián)p傷，使細(xì)胞存活率明顯升高（P<0.001），見表2。

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各組細(xì)胞存活率、LDH及CPK活性、細(xì)胞凋亡率比較 （n=6，±s）

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各組細(xì)胞存活率、LDH及CPK活性、細(xì)胞凋亡率比較 （n=6，±s）

**P<0.01；（1）∶（2）～（4），（2）∶（4），（3）∶（4）， 均 P<0.001，（2）∶（3）P>0.05

?

2.3 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對(duì)LPS損傷后LDH、CPK的影響 LPS處理使LDH及CPK較對(duì)照組明顯升高（P<0.001），而轉(zhuǎn)染了pFLAG-14-3-3γ的細(xì)胞再受到LPS損傷處理，LDH及 CPK較LPS組及pFLAG+LPS 組明顯降低（P<0.001），見表2。

2.4 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對(duì)LPS損傷后細(xì)胞凋亡的影響 LPS處理使心肌細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加（P<0.001），轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ 的細(xì)胞能明顯對(duì)抗LPS所致的損傷，與LPS損傷組相比細(xì)胞凋亡率明顯減少（P<0.001），見表2、圖2。

Figure 2 The cell apoptosis detected by flow cytometry in different groups圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.5 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對(duì)LPS損傷后Bax表達(dá)與分布的影響 對(duì)照組Bax主要分布在胞漿，當(dāng)心肌細(xì)胞遭受LPS損傷時(shí)，Bax移位至線粒體，胞漿/線粒體（cyto-Bax/mito-Bax）比值較對(duì)照組明顯減少（P<0.001）。轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ 能明顯對(duì)抗Bax向線粒體的移位，使cyto-Bax/mito-Bax比值較LPS組和 pFLAG+LPS組明顯升高（P<0.001），見表3、圖3。

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平 （n=6，±s）

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平 （n=6，±s）

**P<0.01

?

Figure 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups圖3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平

3 討論

3.1 14-3-3蛋白的基本生理作用 14-3-3蛋白是存在于幾乎所有生物體細(xì)胞中的一類重要蛋白質(zhì)家族，共有 β、ε、γ、η、σ、τ、ζ7 個(gè)亞型。14-3-3 蛋白主要通過(guò)與配體蛋白的相互作用，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、緊張反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[5]。其中14-3-3蛋白最常見的作用方式就是將其配體蛋白限制在某一特定部位，通常是在胞漿，使其無(wú)法到達(dá)功能部位發(fā)揮作用[6]。

3.2 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒對(duì)心肌LPS損傷的對(duì)抗作用 本課題組前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，14-3-3γ在大鼠燒傷及內(nèi)毒素?fù)p傷模型中心肌表達(dá)明顯升高[3]，高度懷疑此蛋白可能在內(nèi)毒素致心肌損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為驗(yàn)證此假說(shuō)，并排除整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多因素干擾，筆者構(gòu)建了pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒，建立原代SD乳鼠心肌細(xì)胞LPS損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3γ后，心肌細(xì)胞能明顯對(duì)抗隨后發(fā)生的LPS損傷，使細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞損傷減輕，表現(xiàn)為L(zhǎng)DH、CPK活性下降，心肌細(xì)胞凋亡減少。

3.3 pFLAG-14-3-3γ抗心肌LPS損傷作用與抑制Bax線粒體移位有關(guān) 有文獻(xiàn)報(bào)道，在神經(jīng)細(xì)胞胞漿中14-3-3蛋白與Bcl-2家族中的Bax結(jié)合[7]。Bcl-2家族是在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，影響線粒體的功能來(lái)完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bax是Bcl-2家族中的促細(xì)胞凋亡蛋白成員，通常情況下，Bax蛋白一般存在于胞漿內(nèi)，受到相關(guān)的凋亡信號(hào)刺激時(shí)，移位至線粒體，直接或間接地與線粒體通道蛋白相互作用，引起促凋亡因子細(xì)胞色素C等的釋放[8]。為此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Bax蛋白在細(xì)胞漿與線粒體中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)心肌細(xì)胞遭受LPS損傷時(shí)，Bax蛋白由胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移，而當(dāng)轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3γ后，Bax蛋白的這種向線粒體遷移則明顯抑制，說(shuō)明在心肌細(xì)胞胞漿中14-3-3γ能抑制LPS誘導(dǎo)Bax向線粒體的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而維持線粒體膜的穩(wěn)定性，起到對(duì)抗LPS損傷的作用。

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