徐 勤 高 珊

喉鱗癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致，受細(xì)胞內(nèi)多種因素控制。Livin是一種特殊的細(xì)胞凋亡抑制劑，具有抗凋亡特性。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者。本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平探討Livin和Caspase-3這2種蛋白在喉癌組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討其在喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律及其與臨床病理特征的關(guān)系，為喉癌的預(yù)防、預(yù)后評估及基因治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院耳鼻咽喉科2008年1月—2010年12月住院手術(shù)的62例喉癌患者的喉癌組織標(biāo)本，所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌，全部病例術(shù)前均未行放療、化療，臨床資料完整。喉癌患者中男52例，女10例；年齡42～76歲,中位年齡61歲，其中＜60歲者22例，≥60歲者40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例（有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)術(shù)后病理而定）；病理學(xué)分級：G1（高分化）組30例，G2（中分化）組 20 例，G3組（低分化）12 例；臨床分期采用國際抗癌協(xié)會 （UICC）2010年公布的TNM分類分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期34例；聲門上型 40例，聲門型22例；發(fā)病前吸煙史（每日＞20支）20年以上者48例，為吸煙組，余14例為對照組。收集30例聲帶息肉患者活檢組織做為對照組，并經(jīng)病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜。所有標(biāo)本取材后常規(guī)石蠟包埋，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器耗材 兔抗人Livin單克隆抗體 （武漢博士德BA1743）、兔抗人Caspase-3單克隆抗體 （北京中衫金橋ZA-0420）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體 （中杉金橋ZB-2301）、即用型DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。顯微鏡（日本OlympusBX40F4）、熒光顯微鏡（日本Olympus）、顯微照相系統(tǒng)（日本 Olympus）。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，具體步驟如下：石蠟切片（5μm），常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，在微波爐里抗原修復(fù)15 min，室溫放置 40 min，PBS沖洗 3次×5 min，小牛血清封閉 10 min，滴加一抗 50 μL（1∶100 工作液）4 ℃過夜，PBS 洗 3次×5 min，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS洗3次×5 min，DAB顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，透明，封片，鏡檢。

1.4 結(jié)果判定 Livin、Caspase-3主要表達(dá)于細(xì)胞漿，部分位于細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知喉癌陽性組織切片為陽性對照。以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，并采用Volm雙評分法進(jìn)行判定。在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5個高倍鏡視野（×200），一方面按陽性細(xì)胞百分率（A值） 評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分；一方面按染色強(qiáng)度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將染色陽性細(xì)胞數(shù)（A值）與染色強(qiáng)度（B 值）相加判斷結(jié)果：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4 分，強(qiáng)陽性（+++）：5～6 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)Excel數(shù)據(jù)庫整理，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。等級資料采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用 Spearman等級相關(guān)分析 Livin和Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達(dá) 在62例喉癌標(biāo)本中，Livin的陽性表達(dá)率為67.74%，高于聲帶息肉組織的6.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z=3.778，P＜0.01)，見表1，圖1、2。

Table 1 The expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表1 Livin在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達(dá)情況例（%）

2.2 Livin與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 62例喉癌組織中，Livin的表達(dá)在淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、不同臨床分期及不同分化程度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），在不同臨床分型、有無吸煙史、不同年齡及性別方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Table 2 The relationships between Livin and Caspase-3 expression and clinical pathological characteristics in laryngeal squamous cell carcinoma表2 Livin和Caspase-3蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 例（%）

Figure 1 The high expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma（SP×200）圖1 Livin蛋白在喉鱗癌組織中的高表達(dá)（SP×200）

2.3 Caspase-3在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達(dá)情況 在喉癌組織標(biāo)本中，Caspase-3陽性表達(dá)率僅為51.61%，低于聲帶息肉組織的86.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.485，P＜0.05），見表3，圖3、4。

Figure 2 The low expression of Livin in polyp of vocal cord（SP×200）圖2 Livin蛋白在聲帶息肉組織中的低表達(dá)（SP×200）

Table 3 Expressions of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表3 Caspase-3在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達(dá)情況例（%）

Figure 3 The low expression of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma（SP×200）圖3 Caspase-3蛋白在喉鱗癌組織中的低表達(dá)（SP×200）

Figure 4 The high expression of Caspsee-3 in polyp of vocal cord（SP×200）圖4 Caspsee-3蛋白在聲帶息肉組中的高表達(dá)（SP×200）

2.4 Caspase-3蛋白陽性表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 在62例喉癌組織中，Caspase-3蛋白的表達(dá)在淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、不同臨床分期及不同分化程度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在不同臨床分型、有無吸煙史、不同年齡及性別方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.5 Livin與Caspase-3的相關(guān)性 Livin表達(dá)陽性的42例喉癌組織中，Caspase-3陽性20例（47.62%）；Livin表達(dá)陰性的20例喉癌組織中，Caspase-3陽性12例（60.00%）。Livin與Caspase-3在喉癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.448，P＜0.05）。

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of a apoptosis protein,IAPs）中的成員，于2002年從人類基因組cDNA文庫中克隆獲得。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4.6 kb，其含有IAPs家族成員所特有的凋亡抑制蛋白重復(fù)序列（BIR）和一個羧基端環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING結(jié)構(gòu)域）。在正常組織中未見表達(dá)及低表達(dá)，而在腫瘤組織中高度表達(dá)[1]。研究顯示，Livin在多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，如骨肉瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌等[2-4]。Caspase蛋白酶家族即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，是包括人類在內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶類。Caspase-3是Caspase家族成員中最重要的效應(yīng)因子，處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞的因素最終均需要通過Caspase-3介導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。Caspase-3廣泛表達(dá)于正常人體組織和多種腫瘤組織中。已有研究顯示，Caspase-3在腫瘤中的表達(dá)較正常組織明顯降低[6-7]。Livin和Caspase-3均作為凋亡通路中的重要作用蛋白，Livin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制有：在抑制Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑中，Livin可以直接抑制核心蛋白Caspase-3的活性，阻斷其級聯(lián)反應(yīng)，從而抑制凋亡進(jìn)程[8]。其含有BIR2功能區(qū)的凋亡抑制蛋白具有與Caspase-3直接結(jié)合的功能，而抑制其凋亡活性；還可與Caspase-7、Caspase-9結(jié)合阻礙多種途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；還可以激活TAK1/JNK1信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗凋亡作用。Crnkovic-Mertens等[9]利用siRNA技術(shù)干擾宮頸癌Hela細(xì)胞中內(nèi)源性Livin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Livin的表達(dá)受到干擾后，可有效抑制Hela細(xì)胞生長，并且在凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。同樣，其他一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在肺癌、胃腸癌、乳腺癌患者血清中檢測到抗Livin抗體，而且在腫瘤壞死轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)帶有Livin特異性的CD4+與CD8+T細(xì)胞浸潤，這些現(xiàn)象又從側(cè)面提示Livin可能既參與惡性腫瘤生長、增殖過程，也可能參與誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[10-12]。

已有一些研究表明Livin和Caspase-3在細(xì)胞癌變過程中的相互作用關(guān)系。Liu等[13]研究證實(shí)了Livin通過抑制Caspase-3活性而抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)惡性腫瘤生長。隨麗娜[14]通過對口腔白斑及口腔鱗狀細(xì)胞癌中Livin和Caspase-3蛋白的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)Livin和Caspase-3不僅在口腔白斑組織與口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)具有顯著差異，而且Livin和Caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。卓賢露等[15]檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Livin的陽性表達(dá)率為70.73%，顯著高于正常組織，同時Livin在喉鱗狀細(xì)胞癌中陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。謝洪等[16]的研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織中。本研究結(jié)果顯示，喉鱗癌組織中Livin陽性率高于聲帶息肉組織，Caspase-3陽性率低于聲帶息肉組織，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究結(jié)果還顯示在淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、不同臨床分期及不同分化程度之間，Livin和 Caspase-3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Livin與Caspase-3在喉癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.448）。表明Livin基因可能通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，Livin的陽性率隨著喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率升高而增高，表明Livin對判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要價(jià)值。通過多年大量臨床觀察及研究結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響喉癌預(yù)后的最主要因素。不能對其侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期準(zhǔn)確預(yù)測是導(dǎo)致治療失敗和難以客觀評估預(yù)后的主要原因，Caspase-3的表達(dá)下調(diào)可以作為反映惡性腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[17]。Elaliz等[18]檢測胃腸道惡性腫瘤及健康對照者血清中抗Livin抗體，認(rèn)為Livin可能成為新的胃腸道惡性腫瘤檢測抗原。El-Mesallamy等[19]在急性白血病患者治療過程中檢測Livin表達(dá)量并進(jìn)行患者緩解率及預(yù)后分析后認(rèn)為Livin可以作為急性白血病預(yù)后判斷指標(biāo)之一。通過對Livin與Caspase-3關(guān)系的進(jìn)一步研究，幫助人們進(jìn)一步認(rèn)識腫瘤轉(zhuǎn)移的特征，提高對腫瘤臨床分期和預(yù)后的判斷水平，以更好地指導(dǎo)治療及監(jiān)測治療效果。

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