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        冬凌草甲素抑制體內(nèi)外卵巢癌生長(zhǎng)的作用

        2012-11-28 01:33:04胡瑞華李紅英周利敏謝麗微
        天津醫(yī)藥 2012年3期
        關(guān)鍵詞:生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

        胡瑞華 王 燕 李紅英 周利敏 謝麗微

        目前卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第3位,卵巢癌患者的5年生存率僅為40%左右,化療在卵巢癌治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用,但由于腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性,使得傳統(tǒng)化療藥物治療卵巢癌的效果不理想。目前,中醫(yī)藥用于惡性腫瘤的治療受到越來(lái)越多的關(guān)注。冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(lèi)天然有機(jī)化合物,研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能抑制胰腺癌[1]、肺癌[2]、前列腺癌[3]和肝癌[4]等多種腫瘤細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,臨床試驗(yàn)也證明該化合物對(duì)人體重要臟器如骨髓、肝、腎等無(wú)明顯損傷[5],但目前少見(jiàn)有冬凌草甲素對(duì)卵巢癌作用的研究報(bào)道。本研究擬探討冬凌草甲素對(duì)體內(nèi)外卵巢癌生長(zhǎng)的抑制作用,為卵巢癌的臨床治療提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料 胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);MTT試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);核因子(NF)-κB抗體(美國(guó)Epitomics公司);X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);免疫組化SP試劑盒(德國(guó)寶靈曼公司);Ki-67抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);冬凌草甲素(中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所)用含30%DMSO(美國(guó)Sigma公司)的滅菌三蒸水配成5 mmol·L-1母液,置-20℃保存,應(yīng)用時(shí)加RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成目標(biāo)濃度(DMSO的終濃度<0.1%,該濃度無(wú)明顯細(xì)胞毒作用)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只4~6周齡SPF級(jí)健康BALB/c雌性裸鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量18~20 g,飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi),控制室溫和濕度。

        1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM購(gòu)自ATCC,培養(yǎng)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,生長(zhǎng)至70%~80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。

        1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910PM細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200 μL;過(guò)夜至細(xì)胞完全貼壁后棄上清,分別加入不同濃度冬凌草甲素(10、20、40 μmol/L),每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔;同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞加入等量的0.1%DMSO)及陰性對(duì)照組(加細(xì)胞加入等量的0.1%DMSO),分別培養(yǎng)24 h;結(jié)束培養(yǎng)前4 h每孔加入5 g/L的MTT液10μL后放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),終止培養(yǎng)后棄上清,每孔加DMSO 100μL,輕微振蕩10 min,待孔內(nèi)結(jié)晶完全溶解并色素均勻后上酶標(biāo)儀492 nm檢測(cè)各孔光密度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值)×100%。

        1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染色法。HO-8910PM細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素(40μmol/L)作用24 h后,收集細(xì)胞約5×105個(gè),以500μL的結(jié)合緩沖液重懸,按試劑盒說(shuō)明加入5μL AnnexinV-FITC混勻后,再加入5μL PI,混勻后避光,室溫反應(yīng)15 min,置流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率。

        1.6 Western blot檢測(cè)HO-8910PM細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平 不同濃度冬凌草甲素(10、20、40μmol/L)作用HO-8910 PM細(xì)胞24 h后。抽提蛋白質(zhì),取40μg蛋白質(zhì)經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉(SDS)·聚丙酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)濾膜上,與NF-κB或XIAP一抗室溫孵育3 h,再與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,漂洗后進(jìn)行蛋白印跡法檢測(cè),ECL顯色,X線膠片曝光。用Image J分析軟件將每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)與目的蛋白灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.7 裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立和給藥方案 收集2×107個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910PM細(xì)胞懸浮于0.2 mL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基,注射至每只裸鼠背部皮下,術(shù)后裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)室,接種2周后,以皮下瘤體結(jié)節(jié)直徑>0.5 cm為接種成瘤標(biāo)準(zhǔn),接種裸鼠的成瘤率為100%。挑選皮下移植瘤直徑為0.5 cm的裸鼠20只,將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組10只,分別灌胃給予0.1%DMSO 0.2 mL/只和冬凌草甲素40 mg/kg,每周一、三、六分別給藥,連續(xù)3周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,2組裸鼠均有少量動(dòng)物在治療期間出現(xiàn)不同程度腹瀉和稀便表現(xiàn),但療程結(jié)束也隨之停止;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,僅對(duì)照組裸鼠有1只死于惡液質(zhì);接種42 d后,頸椎脫臼處死裸鼠,迅速剪開(kāi)皮膚,完整剝離腫塊稱(chēng)質(zhì)量后計(jì)算抑瘤率,抑瘤率=[1-(實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始時(shí)平均體質(zhì)量-結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量)/(對(duì)照組開(kāi)始時(shí)平均體質(zhì)量-結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量)]×100%

        1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67、NF-kB和XIAP表達(dá) 所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋,5μm厚度連續(xù)切片。按照免疫組化SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色,并以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。高倍鏡(×400)下隨機(jī)讀取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算鏡下陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

        2 結(jié)果

        2.1 冬凌草甲素對(duì)體外卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞增殖的影響 HO-8910PM細(xì)胞經(jīng)不同濃度(10、20、40μmol·L-1)冬凌草甲素作用24 h后,細(xì)胞存活率分別為(80.14±9.84)%、(71.68±6.51)%和(64.58±5.24)%,均低于對(duì)照組的(96.12±4.23)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.565,P<0.05;組間比較P分別為0.001、<0.001、<0.001)。

        2.2 冬凌草甲素對(duì)卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞凋亡的影響 冬凌草甲素(40μmol·L-1)作用HO-8910PM細(xì)胞24 h后,誘導(dǎo)(15.9±3.4)%的HO-8910PM細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,高于對(duì)照組的(1.7±0.3)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.428,P<0.001),見(jiàn)圖1。

        2.3 冬凌草甲素對(duì)HO-8910PM細(xì)胞中NF-κB和XIAP蛋白表達(dá)的影響 NF-κB、XIAP和β-actin的陽(yáng)性特異性條帶分別為70 ku、53 ku和43 ku,見(jiàn)圖2。3種濃度(10、20、40 μmol·L-1)的冬凌草甲素作用24 h,均可抑制HO-8910PM細(xì)胞中NF-κB的表達(dá);而低濃度(10 μmol·L-1)冬凌草甲素對(duì)HO-8910PM細(xì)胞中XIAP蛋白無(wú)明顯抑制作用,高濃度冬凌草甲素(20和40 μmol·L-1)明顯抑制XIAP蛋白的表達(dá),見(jiàn)表1。

        2.4 冬凌草甲素對(duì)裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)照組腫瘤平均質(zhì)量為(0.91±0.28)g;實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均質(zhì)量為(0.45±0.16)g,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.418,P=0.004)。抑瘤率為56.79%。

        2.5 冬凌草甲素對(duì)裸鼠腫瘤組織細(xì)胞Ki-67、NF-κB和XIAP表達(dá)的影響 Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿不著色,胞核染成棕褐色,核固縮,染色質(zhì)濃聚;NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿和胞核為棕褐色;XIAP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿為棕褐色,見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)組中Ki-67、NF-κB和XIAP的表達(dá)強(qiáng)度均低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2。

        Table 1 Relative expression levels of NF-κB and XIAPprotein in HO-8910PM cells of different experimental groups表1 各組HO-8910PM細(xì)胞中NF-κB和XIAP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較 (n=6,±s)

        Table 1 Relative expression levels of NF-κB and XIAPprotein in HO-8910PM cells of different experimental groups表1 各組HO-8910PM細(xì)胞中NF-κB和XIAP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較 (n=6,±s)

        **P<0.01

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        Table 2 Expressions of Ki-67,NF-κB and XIAPbetween two groups表2 2組Ki-67、NF-κB和XIAP的表達(dá) (n=10,%)

        3 討論

        近年來(lái)研究表明新型抗腫瘤藥物冬凌草甲素能有效抑制多種惡性腫瘤生長(zhǎng),其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方式以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主,而對(duì)機(jī)體無(wú)明顯不良反應(yīng),沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。但以往研究對(duì)冬凌草甲素抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚不十分明確。本研究表明冬凌草甲素能有效地誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在冬凌草甲素抑制卵巢癌生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定作用;同時(shí)本實(shí)驗(yàn)觀察到冬凌草甲素能有效地抑制卵巢癌皮下移植瘤的生長(zhǎng),并且冬凌草甲素作用后腫瘤組織中細(xì)胞增值因子Ki-67陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著降低,與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿;另外,在本實(shí)驗(yàn)中裸鼠在冬凌草甲素給藥期間僅有輕微不良反應(yīng),考慮到本實(shí)驗(yàn)中冬凌草甲素的溶劑DMSO對(duì)動(dòng)物有一定不良反應(yīng),對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也出現(xiàn)類(lèi)似的不良反應(yīng),因此可以基本排除冬凌草甲素對(duì)本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不良反應(yīng),表明冬凌草甲素在對(duì)機(jī)體無(wú)明顯影響的前提下仍可顯著抑制卵巢癌生長(zhǎng),提示冬凌草甲素可作為一種新型抗腫瘤藥應(yīng)用于卵巢癌的治療。

        細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理和病理過(guò)程,是細(xì)胞主動(dòng)參與的“自殺”機(jī)制,而細(xì)胞凋亡的發(fā)生取決于凋亡抑制蛋白和促凋亡蛋白的對(duì)決。在凋亡抑制蛋白中,近年來(lái)受到較大關(guān)注的是IAPs(Inhibi?tor of Apoptosis Proteins)家族,XIAP是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAPs家族中最重要的凋亡抑制蛋白,XIAP在大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞株中呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài),XIAP可直接抑制Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),特別是Caspase-3的激活而抑制細(xì)胞凋亡,從而與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[7],抑制XIAP的表達(dá)能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,XIAP在體內(nèi)外卵巢癌中呈高表達(dá),而冬凌草甲素不僅能下調(diào)體外卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞中XIAP的表達(dá),還能顯著抑制體內(nèi)卵巢癌中XIAP的表達(dá),另外冬凌草甲素還能有效抑制體內(nèi)外卵巢癌生長(zhǎng),從而表明下調(diào)XIAP在冬凌草甲素抑制體內(nèi)外卵巢癌中發(fā)揮了一定作用。

        NF-κB為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族,與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)等多種惡性生物學(xué)行為有密切聯(lián)系,NF-κB可調(diào)控一系列凋亡相關(guān)基因如IAPs家族等,從而在調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥和促進(jìn)細(xì)胞生存中起到關(guān)鍵作用[8-9]。因此,抑制NF-κB能有效降低凋亡抑制因子對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用,從而有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中,冬凌草甲素能下調(diào)NF-κB及其調(diào)控蛋白XIAP在HO-8910PM細(xì)胞中及在體內(nèi)卵巢癌中的表達(dá);且其還能有效抑制體內(nèi)外卵巢癌生長(zhǎng),表明冬凌草甲素可通過(guò)抑制NF-κB及其調(diào)控蛋白XIAP等,進(jìn)而抑制體內(nèi)外卵巢癌生長(zhǎng)。

        [1]宋芳,馮一中,蔣小嵐,等.冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌SWl990細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(2):240-243.

        [2]Leung CH,Grill SP,Lam W,etal.Novel mechanism of inhibition of nuclear factor-kappa B DNA-binding activity by diterpenoids iso?lated from Isodon rubescens[J].Mol Pharmacol,2005,68(2):286-297.

        [3]Ikezoe T,Chen SS,Heber D,etal.Baicalin is a major component of PC-SPESwhich inhibits the proliferation of human cancer cells via apoptosisand cell cyclearrest[J].Prostate,2001,49(4):285-292.

        [4]Zhang JF,Liu JJ,Liu PQ,etal.Oridonin inhibits cell growth by in?duction of apoptosis on human hepatocelluar carcinoma BEL-7402 cells[J].Hepatol Res,2006,35(2):104-110.

        [5]Li XT,Lin C,Li PY.Characteristics of thecytostatic effects of ofido?nin in vitro[J].Acta Pharmacol Sin,1986,7(4):361-363.

        [6]崔僑,田代真一,小野寺敏,等.冬凌草甲素通過(guò)誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬下調(diào)凋亡[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(1):183-187.

        [7]Jost PJ,Grabow S,Gray D,etal.XIAPdiscriminates between type I and type II FAS-induced apoptosis[J].Nature,2009,460(7258):1035-1039.

        [8]Banerjee S,Kaseb A O,Wang Z.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin is augmented by thymoquinone in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2009,69(13):5575-5583.

        [9]Kunnumakkara AB,Guha S,Krishnan S,etal.Curcumin potenti?atesantitumor activity of gemcitabine in an orthotopic model of pan?creatic cancer through suppression of proliferation,angiogenesis,and inhibition of nuclear factor-kappaB-regulated gene products[J].Cancer Res,2007,67(8):3853-3861.

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