于 倩 張 沫 劉德敏

糖尿病腎?。―N）早期處于高功能狀態(tài)，腎血流量增加，腎小球?yàn)V過率增高，尿微量蛋白正常，病理變化表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜基質(zhì)輕度增寬，腎小球基底膜輕度增厚。這種過程是可逆的，但隨著病程延長(zhǎng)，當(dāng)尿蛋白排泄率超過0.5 g/d時(shí)，即為臨床糖尿病腎病期，此過程不可逆，最終發(fā)展為終末期腎病，只能依靠腎移植、血液透析和腹膜透析等腎臟替代療法來維持生命，因此積極探索DN的發(fā)病機(jī)制，在DN早期給予適當(dāng)及時(shí)的干預(yù)措施至關(guān)重要。在DN發(fā)病機(jī)制的研究中，由糖基化終末產(chǎn)物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1/Smad/結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）通路最為重要，大量研究表明TGF-β 1和CTGF在腎病進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[1]，但TGF-β1和CTGF基因表達(dá)與早期DN的關(guān)系還不清楚。本研究旨在探討TGF-β1和CTGF基因表達(dá)與糖尿病早期腎臟病變的關(guān)系及其作用機(jī)制，為臨床DN的早期治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔級(jí)雄性SD大鼠27只，購(gòu)自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，平均（281±11）g。實(shí)驗(yàn)期間標(biāo)準(zhǔn)條狀飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，每籠6～7只，自然晝夜光線，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫18℃～22℃，相對(duì)濕度40%～70%。（2）主要試劑。鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司），Real-time PCR試劑盒[大連寶生物（TaKaRa）公司],小鼠抗TGF-β1單克隆抗體、山羊抗CTGF多克隆抗體（Santa Cruz biotechnology），SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。（3）主要儀器。德國(guó)BIOSEN血糖分析儀，芬蘭Quik read快速分析儀，日立CF-15D冷凍離心機(jī)，中國(guó)博日Line-Gene K熒光定量PCR儀。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組 全部動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組（NC）12只，糖尿病組（DM組）15只。將STZ溶于0.1mol/L的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.4），配成2%的溶液。DM組大鼠按40 mg/kg體質(zhì)量尾靜脈注射STZ，對(duì)照組注射枸櫞酸鈉緩沖液。給藥后72 h和第7天尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖，2次血糖均≥16.7 mmol/L為造模成功，共14只成模為DM組。

1.3 標(biāo)本收集與處理 自成模之日起，每2周測(cè)血糖1次。第8周時(shí)將大鼠置于單個(gè)代謝籠中，收集24 h尿液，記錄尿量，3 000 r/min離心3 min后留取上清于-20℃保存，用于24 h尿微量蛋白（UMA）的測(cè)定。第8周末，將全部大鼠稱質(zhì)量，測(cè)血糖，股動(dòng)脈放血將大鼠處死，留取血標(biāo)本，3 000 r/min離心5 min后取血清于-20℃凍存，待測(cè)血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指標(biāo)。將大鼠腹腔打開，迅速摘取雙腎，左腎稱質(zhì)量后迅速放入10%福爾馬林固定，右腎去除包膜后留取腎皮質(zhì)部分于凍存管中，編號(hào)后放入液氮保存，24 h后放入-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，用于Real-time PCR測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 生化指標(biāo)的測(cè)定 血糖檢測(cè)用葡萄糖氧化酶電極法，BUN、Scr測(cè)定用酶法，24 h尿微量蛋白檢測(cè)用免疫透射比濁法。

1.4.2 腎臟肥大指數(shù)（KI） 用腎質(zhì)量/體質(zhì)量（g/kg）比值表示。

1.4.4 腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGFmRNA表達(dá)測(cè)定 （1）腎皮質(zhì)總RNA提取。用Trizol按步驟提取大鼠腎皮質(zhì)總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣品OD260/OD280比值，結(jié)果在1.8～2.0為純度較高，并計(jì)算濃度，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。（2）cDNA的合成。以RNA為模板，oligo（dT）為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV的催化下合成cDNA。（3）引物合成。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，′用NCBIblast評(píng)價(jià)，再由上海生工合′成。β′-actin引物上游5-CCCATCTA TGA′GGGTTACGC-3，下游5-TTTAATGT′CACGCACGATTT C-3，擴(kuò)增產(chǎn)物1′50 bp；TG′F-β1引物上游5-CAACAACG′CAA TCTATGACA-3，下游5-CAAGG′TAACGCCAGGAAT-3，擴(kuò)增產(chǎn)′物 200 bp′；C TGF引物上游5-TGCCTG′CCATTACAACT G-3，下游5-CACACGGTTCTCACTTCG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物247 bp。（4）Real-time PCR。SYBRGreenⅠ與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBRGreenⅠ的熒光強(qiáng)度監(jiān)測(cè)RCR產(chǎn)物的擴(kuò)增量。反應(yīng)體系包括12.5μL SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 9.5 μL，總體系為25μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后生成熔解曲線。目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增閾值的差值，即△Ct值，根據(jù)公式2-ΔCt計(jì)算出樣品初始模板量進(jìn)行分析。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 固定的腎組織經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋切片（4μm），用免疫組化SABC法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中TGF-β1、CTGF蛋白一抗?jié)舛葹?∶150，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果分析參考文獻(xiàn)[2]，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析,每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)不重疊的視野，計(jì)算其積分光密度（IOD），取其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件做數(shù)據(jù)分析。所有資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，2組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物成模情況及體征觀察 DM組大鼠于造模3 d后出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，常伴有腹瀉，毛發(fā)干枯發(fā)黃，隨時(shí)間的推移體質(zhì)量明顯減輕，活動(dòng)量減少，精神萎靡。NC組大鼠皮毛光滑、毛色正常，體質(zhì)量隨周齡增加而增加，精神狀況佳，飲食、飲水正常，尿淡黃色，大便顆粒狀。實(shí)驗(yàn)期間NC組大鼠無死亡，DM組死亡2只，主要集中在造模后2周。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 前4周時(shí)，與NC組相比，DM組血糖明顯升高（P<0.01）；6周后，DM組血糖略有降低，但仍明顯高于NC組，見表1。與NC組相比，DM組血肌酐明顯下降，血尿素氮明顯升高（均P<0.01），見表2。與NC組相比，DM組24 h尿量升高明顯，24 h UMA、腎肥大指數(shù)也明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

與NC組相比，DM組TGF-β1、CTGF mRNA水平明顯升高（P<0.01），見表3。

免疫組化結(jié)果顯示，NC組腎臟TGF-β1在腎小球輕度染色，DM組腎小球著色明顯增多增深，蛋白表達(dá)較NC組高（P<0.01）；NC組腎小球未見明顯著色，而DM組大鼠腎小球CTGF表達(dá)增多著色明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3，圖1、2。

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

**P<0.01；表2、3同

?

Table 2 Comparison of correlation index of renal function between rat groups表2 各組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)比較 （n=12）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平（n=12，±s）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平（n=12，±s）

?

Figure1 Resultsof nephridialtissue TGF-β1 detected by immunohistochemistry圖1 腎組織TGF-β1免疫組化結(jié)果（SABC法×400，箭頭所示為陽(yáng)性棕色顆粒沉著）

Figure2 Resultsof nephridialtissue CTGFdetected by immunohistochemistry圖2 CTGF腎組織免疫組化結(jié)果（SABC法×400，箭頭所示為陽(yáng)性棕色顆粒沉著）

3 討論

3.1 糖尿病腎病大鼠模型的建立 目前，STZ誘導(dǎo)建立的DM模型廣泛應(yīng)用于DN發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究。STZ通過選擇性抑制β細(xì)胞O-乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase）的活性，從而抑制O-乙酰葡萄糖胺的降解，使β細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)不可逆地糖基化，導(dǎo)致β細(xì)胞死亡。高劑量注射STZ使胰島素分泌嚴(yán)重受損，模擬了1型糖尿??；而低劑量STZ使胰島素分泌輕度受損，具有2型糖尿病后期的特征[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，采用單側(cè)腎臟切除或單側(cè)腎臟結(jié)扎后再小劑量注射STZ，也可以成功建立DN模型，但是由于難于分辨單側(cè)腎損傷和STZ誘導(dǎo)高血糖對(duì)腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變的作用，該模型的應(yīng)用價(jià)值尚待討論[4]。無論從腎臟生理解剖特點(diǎn)還是DN的發(fā)病機(jī)制、病理特征等方面，還沒有一種動(dòng)物模型能完全模擬人類的糖尿病腎臟損害，應(yīng)根據(jù)研究目的選擇模型的建立方法。本實(shí)驗(yàn)研究早期DN的分子機(jī)制及可能的治療方法，因此采用尾靜脈小劑量注射STZ的方法建立DN模型。

3.2 細(xì)胞因子與DN TGF-β1是DN病程進(jìn)展的重要細(xì)胞因子，是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積的關(guān)鍵因子，通過TGF-β/Smad通路與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[5]，其中CTGF是其主要的效應(yīng)因子，與TGF-β1共同參與腎臟肥大、系膜基質(zhì)擴(kuò)張、膠原增加和纖維黏連蛋白mRNA的表達(dá)等作用。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，能與多種細(xì)胞因子相互作用，在維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用[6]。CTGF通過vWC結(jié)構(gòu)域與TGF-β1結(jié)合，從而加強(qiáng)TGF-β1與相應(yīng)受體的結(jié)合，提高了TGF-β1的有效濃度，同時(shí)還參與調(diào)節(jié)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究顯示，在CTGF基因缺失或基因敲除的細(xì)胞中，由TGF-β1介導(dǎo)的30%的基因都失去了對(duì)它的反應(yīng)[7]。TGF-β1功能的實(shí)現(xiàn)離不開CTGF,只有當(dāng)兩者協(xié)調(diào)作用時(shí)，才能促使發(fā)生持續(xù)的纖維化反應(yīng)[8]。

3.3 糖尿病腎病標(biāo)志物 在腎臟疾病中，特別是DN，UMA可以預(yù)示腎功能的損害程度，與腎病的進(jìn)程密切相關(guān)。李世芬等[4]通過檢測(cè)STZ誘導(dǎo)的DN大鼠的24 h尿蛋白排出量發(fā)現(xiàn)，模型組在造模1周時(shí)就明顯升高，提示此時(shí)就已經(jīng)存在腎功能的損害，并且排出量隨著病程的延長(zhǎng)而增多。但是，近來研究發(fā)現(xiàn)腎小球及腎小管損傷引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化要早于尿蛋白的出現(xiàn)[9]，UMA用于診斷DN的進(jìn)程具有較高的靈敏度，但是特異度較低。

DN早期病理生理改變主要是高濾過和微量蛋白尿，隨后出現(xiàn)腎功能進(jìn)一步損害。本研究DM組大鼠的病變處于糖尿病腎病早期，DM組CTGF mRNA及蛋白表達(dá)較NC組明顯升高，說明CTGF表達(dá)在腎病早期即有增加。有研究顯示，與正常蛋白尿的DN患者比較，微量蛋白尿組的DN患者尿中的CTGF高出10倍，大量蛋白尿組高出100倍[10]。Je?rums等[11]研究表明，CTGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及尿CTGF與腎組織活檢纖維化評(píng)分呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示通過檢測(cè)CTGF來評(píng)價(jià)腎臟損傷將具有更好的特異性，有研究者提出聯(lián)合應(yīng)用CTGF與UMA來區(qū)分大血管損傷性疾病和腎臟疾病[12]，這對(duì)DN的早期診斷將更有意義。

[1]Ziyadeh FN.Mediators of diabetic renal disease:The case for TGF-βas the major mediator[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(1):55-57.

[2]文敏,周波,余資江.免疫組織化學(xué)圖像光度學(xué)參數(shù)的選擇及測(cè)量[J].局解手術(shù)學(xué)雜志，2009,18（6）：377-381.

[3]Franconi F,Seghieri G,Canu S,etal.Are the available experimental models of type 2 diabetes appropriate for a gender perspective[J].Pharmacol Res,2008,57(1):6-18.

[4]李世芬，王心如，王玉翠，等.SD大鼠糖尿病腎病模型構(gòu)建的比較[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（8）：1123-1128.

[5]Qi W，Chen X，Poronnik P,etal.Transforming growth factor-β/con?nective tissue growth factor axis in the kidney[J].Int JBiochem Cell Biol,2008,40(1):9-13.

[6]Brigstock DR.The CCN family:a new stimulus package[J].JEndocri?nol,2003,178(2):169-175.

[7]Shi-wen X，Stanton LA,Kennedy L，etal.CCN2 is necessary for ad?hesive responses to transforming growth factor-beta1 in embryonic fibroblasts[J].JBiol Chem,2006,281(16):10715-10726.

[8]Leask A.Targeting the TGF-beta,endothelin-1 and CCN2 axis to combat fibrosis in scleroderma[J].Cell Signal,2008,20(8):1409-1414.

[9]Otsu H,Can H,Spentzs D，etal.Prediction of diabetic nephropathy using urine proteomic profiling 10 years prior to development of ne?phropathy[J].Diabetes Care,2007,30(2):638-643.

[10]Gilbert RE,Akdeniz A,Weitz S,etal.Urinary connective tissue growth factor excretion in patients with type1 diabetesand nephrop?athy[J].Diabetes Care,2003,26(9):2632-2636.

[11]Jerums G,Premaratne E,Panagiotopoulos S,etal.New and old markers of progression of diabetic nephropathy[J].Diabetes Res Clin Pract,2008，82(Suppl 1)：30-37.

[12]Nguyen TQ,Tarnow L,Andersen S,etal.Urinary connective tissue growth factor excretion correlates with clinical markers of renal dis?ease in a large population of type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy[J].Diabetes Care,2006,29(1):83-88.