侍曉辰 張衛(wèi)東 周仕萍

乳腺腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的增殖活性及腫瘤血管的形成密切相關(guān)[1]。雷洛昔芬是第2代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen recep?tor modulator，SERM），與第1代他莫昔芬相比，它們對降低高危女性乳腺癌的發(fā)病率效果相當(dāng)[2]；但雷洛昔芬可降低血脂、預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松，在治療劑量下不升高子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率[3]。最近國外有文獻報道，雷洛昔芬可降低乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖活性[4]，但關(guān)于雷洛昔芬抗血管形成作用的研究尚少見。本文旨在對采用雷洛昔芬治療的絕經(jīng)期后乳腺癌患者進行觀察，探討雷洛昔芬對乳腺癌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、Ki-67、CD34 抗原表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月—2010年12月于無錫市中醫(yī)醫(yī)院乳腺外科就診且病理確診的女性乳腺癌患者20例，年齡52～81歲，平均（63.6±9.3）歲；腫瘤直徑3～5 cm，平均（3.4±0.5）cm。入選標(biāo)準(zhǔn)：絕經(jīng)1年以上；既往無乳腺癌放、化療史；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期法（2003）乳腺癌Ⅱ期；組織學(xué)類型為浸潤性導(dǎo)管癌；雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性。

1.2 方法 對患者進行嚴(yán)格的病史詢問、全身體檢、B超及鉬靶片檢查；懷疑惡性腫瘤者采用脈默通活檢系統(tǒng)（美國強生公司）行組織病理學(xué)檢查及免疫組化檢測，確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌且ER陽性者，簽署治療知情同意書后，予雷洛昔芬60 mg/d，連續(xù)服藥21 d后行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)后再次行病理學(xué)檢查及免疫組化檢測。組織標(biāo)本以10%福爾馬林浸泡，石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，免疫組化檢測主要試劑為鼠抗人VEGF單抗（Da Ko公司）；鼠抗人Ki-67、CD-34單抗（Santa Cruz公司）；S-P試劑盒與DAB顯色劑（福建邁新公司），染色程序按試劑盒說明進行。以PBS代替一抗設(shè)立陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo)及結(jié)果判定 （1）VEGF陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：VEGF陽性細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)特異性染色為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片由2名病理醫(yī)師雙盲觀測5個400倍鏡視野，以染色強度計分，與陰性對照相同計0分，淡黃色、棕黃色、黃褐色分別計1、2及3分；再以陽性細(xì)胞比例計分，全部陰性0分，1%～25%，26%～75%，76%～100%細(xì)胞數(shù)陽性分別計1、2、3分，兩項得分相加，≥3分判定為陽性。（2）Ki-67陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)判定：Ki-67陽性細(xì)胞以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片由2名病理醫(yī)師在400倍鏡視野下雙盲計數(shù)1 000個細(xì)胞，自Ki-67陽性表達最強區(qū)域開始計數(shù)，計算染色細(xì)胞百分比，取平均值。（3）微血管密度（microvessel density，MVD）判定：根據(jù)Weidner標(biāo)準(zhǔn)[5]，被CD34單抗染成棕色或棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群者，作為一個微血管單位，先在40倍鏡觀察全視野，選出5個血管豐富的“熱區(qū)”，2名病理醫(yī)師在400倍鏡視野下雙盲計數(shù)染色的微血管3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，雷洛昔芬治療前后的配對計數(shù)資料比較采用Mc Nemar’s檢驗，配對計量資料組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷洛昔芬對乳腺癌VEGF的表達的影響 3例治療前VEGF陰性患者治療后仍為陰性。17例（85%）治療前VEGF陽性的患者中，11例治療后VEGF轉(zhuǎn)陰，6例（30%）仍為陽性。治療前后陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.38，P<0.01）。雷洛昔芬治療前組織標(biāo)本中可見大量棕色的VEGF陽性細(xì)胞，見圖1a；治療后染色細(xì)胞明顯減少，且染色變淺，見圖1b。

2.2 雷洛昔芬對乳腺癌Ki-67表達的影響 雷洛昔芬治療前Ki-67陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為（19.36±1.66）%，組織標(biāo)本中可見大量棕黃色的Ki-67陽性細(xì)胞，見圖2a；治療后Ki-67陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)下降至（12.24±1.42）%，組織標(biāo)本中棕黃色的Ki-67陽性細(xì)胞明顯減少，治療前后陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.86，P<0.01），見圖2b。

Figure1 Immunohistochemical expression VEGF(SP×400)圖1 VEGF表達的免疫組化定位（SP×400）

Figure2 Immunohistochemical expression of Ki-67(SP×400)圖2 Ki-67表達的免疫組化定位（SP×400）

2.3 雷洛昔芬對乳腺癌CD34表達的影響 雷洛昔芬治療前CD34抗原標(biāo)記的腫瘤微血管數(shù)量為46.25±3.88；組織標(biāo)本中可見較多棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，見圖3a；治療后腫瘤微血管數(shù)量下降至23.64±1.53，組織標(biāo)本中棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇明顯減少，治療前后腫瘤微血管數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.93，P<0.01），見圖3b。

Figure3 Immunohistochemical expression of CD34(SP×400)圖3 CD34表達的免疫組化定位（SP×400）

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖活性及腫瘤的微血管形成在乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮核心作用[1]。Ki-67表達于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，是一種細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，反映細(xì)胞的增殖活性；VEGF表達于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，是腫瘤血管生成的最主要調(diào)控因子；CD34抗原特異性表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞，常作為微血管標(biāo)記物。

雷洛昔芬可用于乳腺癌的內(nèi)分泌治療，也可作為乳腺癌高危人群的預(yù)防性用藥，其常用劑量為60 mg/d[2]。國外2項關(guān)于雷洛昔芬對乳腺癌作用的臨床試驗中的用藥時間分別為14 d和22 d[4，6]。本研究選擇的用藥時間為21 d，是根據(jù)我院門診病理回報至患者住院檢查并手術(shù)的等待時間為21 d所設(shè)定。本研究中首次病理標(biāo)本獲取是通過麥默通活檢系統(tǒng)，主要考慮原因為其抽取的標(biāo)本量大，且完整、連續(xù)，方便病理科醫(yī)生做出組織學(xué)報告；對其取材所得病理診斷和免疫學(xué)指標(biāo)與常規(guī)手術(shù)取樣所得結(jié)論一致；且對確診為乳腺癌的患者再行手術(shù)或先行新輔助化療或內(nèi)分泌治療后手術(shù)，不影響整體療效[7]。

Lopes-Costa等[4，6]報道雷洛昔芬可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性。本研究顯示雷洛昔芬可降低乳腺癌組織Ki-67陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，與上述文獻報道一致。此外，Dowsett等[6]研究顯示，雷洛昔芬只抑制ER陽性的乳腺癌細(xì)胞增殖活性，因而本組研究選擇對象均為ER陽性。Blackwell等[8]報道他莫昔芬具有抑制乳腺腫瘤組織血管形成的作用，他莫昔芬的抗血管形成效應(yīng)在ER陰性的動物模型中依然存在，并且認(rèn)為藥物作用并非完全依賴ER，可能是對促血管形成因子的直接作用，如VEGF。但目前國內(nèi)外關(guān)于雷洛昔芬抗血管形成作用的文獻報道較少。本研究結(jié)果顯示，雷洛昔芬可降低乳腺癌組織MVD，抑制腫瘤血管形成，提示雷洛昔芬可明顯降低乳腺癌組織的VEGF陽性率。Mirkin等[9]研究顯示，雷洛昔芬可上調(diào)乳腺癌組織中內(nèi)源性血管生成抑制因子血小板反應(yīng)蛋白1（TSP-1）mRNA，從而增加腫瘤組織TSP-1表達；王紅超等[10]研究認(rèn)為，腫瘤血管生成是促血管生成因子和血管生成抑制因子相互作用的結(jié)果，乳腺癌組織TSP-1表達增強，可影響VEGF的表達強度，降低腫瘤組織MVD，抑制腫瘤血管形成。

綜上所述，雷洛昔芬60 mg/d治療21 d可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性及微血管形成，降低腫瘤組織VEGF的陽性率，但其間的相互關(guān)系及機制仍需進一步研究加以論證。本研究結(jié)果也為進一步探討腫瘤細(xì)胞的增殖與微血管形成間的相關(guān)性，以及VEGF的靶向治療提供一定的參考。

[1]Shivakumar S,Prabhakar BT,Jayashree K,etal.Evaluation of se?rumvascular endothelial growth factor(VEGF)and microvessel den?sity(MVD)as prognostic indicators in carcinoma breast[J].JCancer Res Clin Oncol,2009,135(4):627-636.

[2]Cuzik J,DeCensi A,Arun B,etal.Preventivetherapy for breast can?cer:aconsensusstatement[J].Lancet Oncol,2011,12(5):496-503.

[3]Palacios S.Selective estrogen receptor modulators:the future in menopausal treatment[J].Minerva Ginecol，2011,63(3):275-286.

[4]Lopes-Costa PV,dos Santos AR,dos Santos LG,etal.Evaluation of Ki-67 and Bcl-2 antigen expression in breast carcinomas of women treated with raloxifene[J].Cell Proliferation，2010,43(2):124-129.

[5]Weidner N,Folkman J,Pozza F,etal.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma[J].JNatl Cancer Inst，1992,84(24):1875-1887.

[6]Dowsett M,Bundred NJ,Decensi A,etal.Effect of raloxifene on breast cancer cell Ki67 and apoptosis:a double-blind,place?bo-controlled,randomized clinical trial in postmenopausal patients[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001,10(9):961-966.

[7]顧軍,于澤平,王少華，等.麥默通微創(chuàng)活檢系統(tǒng)對乳腺腫塊診斷的應(yīng)用價值[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2010,23(3):279-281.

[8]Blackwell KL,Haroon ZA,Shan S,etal.Dewhirst MW:Tamoxifen inhibits angiogenesis in estrogen receptor-negative animal model[J].Clin Cancer Res,2000,6(11):4359-4364.

[9]Mirkin S,Wong BC,Archer DF.Effects of 17beta-estradiol,proges?terone,synthetic progestins,tibolone,and raloxifene on vascular en?dothelial growth factor and Thrombospondin-1 messenger RNA in breast cancer cells[J].Int JGynecol Cancer,2006,16(2):560-563.

[10]王紅超,李海平,范忠林,等.血小板反應(yīng)蛋白1在乳腺癌中的表達及意義[J].天津醫(yī)藥,2009,37(10):826-827.