胥光熱，彭永權(quán)，林 靜，劉應(yīng)才

（1.遂寧市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 遂寧 629000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 成都 610041）

槲皮素（quercetin，Que）是醋柳總黃酮的主要單體之一，廣泛存在于蔬菜、水果及植物藥中，在心血管保護(hù)方面起重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Que具有抗氧化的生物學(xué)活性。研究表明其抗氧化主要表現(xiàn)在促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，清除自由基（活性氧/活性氮）；螯合過(guò)度金屬離子；維持和再生α-生育酚等。Que對(duì)冠心?。–HD）具有防治作用已得到研究的充分證實(shí)。EPCs對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病的內(nèi)皮修復(fù)過(guò)程起著重要的作用，其數(shù)量和功能受損可導(dǎo)致內(nèi)皮損傷與修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡破壞。因此，外周血EPCs數(shù)量和功能與冠狀動(dòng)脈的血管損傷密切相關(guān)，是冠心病的危險(xiǎn)因素[1]。氧化應(yīng)激引起EPCs數(shù)量減少和功能減弱，促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展[2]。但對(duì)于Que如何防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，目前尚無(wú)定論。因此，我們通過(guò)體外培養(yǎng)臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀(guān)察Que在氧化應(yīng)激條件下對(duì)EPCs的影響，以探討Que治療冠心病可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

槲皮素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（b-FGF）、DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-ac-LDL）、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Anisomycin購(gòu)自美國(guó)Sigma，人纖連蛋白購(gòu)自Milipure，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）購(gòu)自Pepro Tech，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，鼠抗人p-JNK抗體、小鼠SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自中山金橋，鼠抗人CD133單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森，F(xiàn)ITC-兔抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德，WST-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng) 臍血（每份60 mL）取自瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月健康分娩的新生兒，告知產(chǎn)婦用于科學(xué)研究并得到其認(rèn)可。按1∶3的比例加入明膠，常溫下靜置30min，收集上清液，離心1000 r/min，10min，棄上清液，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋混勻后按3∶2加入人淋巴細(xì)胞分離液上，離心2000 r/min，20 min，小心吸取中間白膜層單個(gè)核細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基離心洗滌2遍，再用M199培養(yǎng)基調(diào)整密度為4×106/mL接種于纖連蛋白包被培養(yǎng)瓶中，另加10%胎牛血清，1%青鏈霉素，VEGF 50 ng/mL，b-FGF 1 ng/mL飽和濕度、5%二氧化碳的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3～4 d換夜；繼續(xù)培養(yǎng)至7～8 d，PBS洗滌掉非貼壁細(xì)胞，收集貼壁細(xì)胞供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 EPCs鑒定 ①細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。②免疫熒光檢測(cè)表面標(biāo)志CD133：培養(yǎng)7 d的貼壁細(xì)胞行細(xì)胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定30min后，3%H2O2孵育10 min，用Triton-100打孔，血清封閉后，加鼠抗人CD133抗體（1∶300稀釋?zhuān)?℃冰箱過(guò)夜，滴加FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG，37℃孵育60min，熒光顯微鏡下觀(guān)察拍照。③細(xì)胞免疫熒光雙染色鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)至9 d后行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁完全后進(jìn)行Dil-ac-LDL熒光染色鑒定。細(xì)胞在含Dil-ac-LDL（2.4μg/mL）的培養(yǎng)液中37℃孵育1 h，然后2%的多聚甲醛固定10min，均勻滴加濃度為10μg/mL FITC-UEA-1于上述標(biāo)本上，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)1 h。PBS漂洗后在熒光顯微鏡下觀(guān)察顯示紅色熒光為ac-LDL陽(yáng)性細(xì)胞，顯示綠色熒光為UEA-1陽(yáng)性，染色雙陽(yáng)性為正在分化的EPCs。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)至第7天后用不含EDTA的0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL，按照每孔2mL接種于6孔板，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、H2O2（500μmol/L）氧化應(yīng)激模型組、Que（60、90和120μmol/L）預(yù)處理30min后H2O2再處理8 h共同干預(yù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后施加上述不同的干預(yù)因素。

1.4 細(xì)胞增殖

將培養(yǎng)7 d的細(xì)胞以2×103個(gè)均勻接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后用不含血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。同時(shí)再加入各種干預(yù)因素繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，每孔加入10μL WST-1溶液，繼續(xù)孵育2 h，置酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 EPCs凋亡的檢測(cè)

雙染免疫熒光法EPCs凋亡的觀(guān)察：培養(yǎng)待檢測(cè)細(xì)胞，PBS洗滌2次后，加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再分別加入5μL的FITC-Annexin-v、PI混勻，室溫避光反應(yīng)10min，將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡雙色濾光片（FITC和羅丹明）下觀(guān)察，F(xiàn)ITC-Annexin-v熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)紅色。在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)收集細(xì)胞懸浮液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算各組細(xì)胞的凋亡率。

1.6 EPCs凋亡機(jī)制研究

1.6.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)EPCs p-JNK蛋白表達(dá) 取出培養(yǎng)7 d的細(xì)胞在6孔板中爬片，40 g/L多聚甲醛固定30 min鐘后，3%H2O2孵育10 min，用Triton-100打孔，血清封閉后，滴加1∶100稀釋的鼠抗人p-JNK一抗，用PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗，37℃孵育30min，PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡觀(guān)察陽(yáng)性信號(hào)。

1.6.2 JNK激動(dòng)劑對(duì)EPCs凋亡的影響 將上述細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、JNK激動(dòng)劑Anisomycin 10μmol/L+H2O2（500μmol/L）組、JNK 激動(dòng)劑 Anisomycin 10μmol/L+Que （60、90 和 120μmol/L）+H2O2（500μmol/L） 組，JNK 激動(dòng)劑組先加入10μmol/L Anisomycin預(yù)處理1 h后再施加其他干預(yù)因素，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定

①剛分離的單個(gè)核細(xì)胞倒置相差顯微鏡下呈圓形，胞體透亮，折光性好，散在分布于培養(yǎng)液中。3～4 d后，圓形細(xì)胞逐漸拉長(zhǎng)，呈梭形貼壁生長(zhǎng)，并有少量細(xì)胞突起（見(jiàn)圖1A）。培養(yǎng)7 d后梭形細(xì)胞較前明顯增多，細(xì)胞體積增大，部分視野可呈集落樣生長(zhǎng)，有一定的方向性（見(jiàn)圖1B）。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征（×200）

②早期EPCs以表達(dá)CD133、CD34為主，晚期可表達(dá)KDR。其中CD133在EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化過(guò)程中其數(shù)量迅速減少。因此，可作為EPCs區(qū)別成熟內(nèi)皮細(xì)胞的分子標(biāo)志[3]。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，陽(yáng)性率達(dá)95%以上。見(jiàn)圖2。

③DiI-ac-LDL染色呈紅色（見(jiàn)圖3），F(xiàn)ITC-UEA-1染色呈綠色（見(jiàn)圖4），DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1免疫熒光雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色，定義為內(nèi)皮祖細(xì)胞[4]，陽(yáng)性率＞90%。見(jiàn)圖5。

圖2 CD133陽(yáng)性細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)

圖3 DiI-ac-LDL染色

圖4 FITC-UEA-1染色

圖5 內(nèi)皮祖細(xì)胞

2.2 Que對(duì)EPCs增殖的影響

在正常培養(yǎng)條件下，與空白對(duì)照組比較，60～90μmol/L的 Que可以促進(jìn) EPCs的增殖，120μmol/L的Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用，與培養(yǎng)24 h比，在48 h對(duì)EPCs的抑制作用較為明顯，差異有顯著性（P ＜0.05）（見(jiàn)表 1）；在氧化應(yīng)激條件下，與空白對(duì)照組比較，H2O2組EPCs增殖能力明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01），加入60～120 μmol/L的Que處理后，H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細(xì)胞增殖能力得到明顯改善，且具有明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)性，與H2O2組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）（見(jiàn)表 2）。

表1 在生理?xiàng)l件下Que對(duì)EPCs增殖的影響（，n=6）

表1 在生理?xiàng)l件下Que對(duì)EPCs增殖的影響（，n=6）

注：1） 與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2） 與對(duì)照組比較，P ＜0.01；3）與60μM Que組比較，P ＜0.05；4）48 h與 24 h相比，P ＜0.05

OD值24 h 48 h對(duì)照組 - 0.2920±0.0112 0.2983±0.0091 Que 60 0.3266±0.00672） 0.3561±0.00612）4）Que 90 0.3416±0.00552）3） 0.3712±0.00752）3）4）Que 120 0.2882±0.01021） 0.2616±0.00382）4）組別劑量/（μmol/L）

2.3 Que對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響

免疫熒光觀(guān)察結(jié)果顯示綠色的為凋亡早期細(xì)胞，紅色為死亡細(xì)胞，核桔黃色而膜綠色為凋亡晚期細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Que在60～120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加，且抗EPCs凋亡作用逐漸增強(qiáng)。在60、90、120μmol/L濃度的Que作用下，凋亡率依次為（27.43±0.37）%、（23.12±0.45）%和（22.43±0.16）%，與 H2O2誘導(dǎo)組（36.58±0.45）%的凋亡率比較，差異有顯著性（P＜0.01）；與 90μmol/L Que+H2O2組比較，120μmol/L Que+H2O2組的凋亡率無(wú)明顯差異（P＜0.05）（見(jiàn)表3，圖6）。免疫細(xì)胞化學(xué)p-JNK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，隨著槲皮素濃度的增加，p-JNK陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物逐漸減少，染色變得淺淡（見(jiàn)圖7）。Que能夠抑制加入JNK激動(dòng)劑后EPCs凋亡率的 增 加 ，Anisomycin+Que（60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L）+H2O2組的凋亡率依次為 （42.36±0.53）%、（38.32±0.15）%和（35.78±0.27）%，與 Anisomycin+H2O2組（47.35±0.64）%比較，差異有顯著性（P＜0.05）。見(jiàn)表 4，圖8。

表2 在氧化應(yīng)激條件下Que對(duì)EPCs增殖的影響（，n=6）

表2 在氧化應(yīng)激條件下Que對(duì)EPCs增殖的影響（，n=6）

注：1） 與對(duì)照組比較，P ＜0.01；2） 與 H2O2組比較，P ＜0.01；3）與60μM Que組比較，P ＜0.05；4）與 90μM Que組比較，P ＜0.05；5）48 h與24 h比較，P＜0.05

OD值24 h 48 h對(duì)照組 - 0.2920±0.0112 0.2983±0.0091 H2O2 500 0.1175±0.00441） 0.1033±0.00551）Que+H2O2 60 0.1336±0.00372） 0.1526±0.00482）5）Que+H2O2 90 0.1568±0.00492）3） 0.1743±0.00492）3）5）Que+H2O2 120 0.1838±0.00512）4） 0.2039±0.00672）4）5）組別 劑量/（μmol/L）

圖6 H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

圖7 免疫細(xì)胞化學(xué)法p-JNK蛋白表達(dá)

表3 Que對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

表3 Que對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

注：1） 與對(duì)照組比較，P ＜0.01；2） 與 H2O2組比較，P ＜0.01；3）與90μM Que+H2O2組比較，P＜0.05

組別劑量/（μmol/L）凋亡率/%對(duì)照組 - 13.52±0.36 H2O2 500 36.58±0.451）Que+H2O2 60 27.43±0.582）3）Que+H2O2 90 23.12±0.372）Que+H2O2 120 22.43±0.162）

表4 JNK激動(dòng)劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

表4 JNK激動(dòng)劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

注：?與 Anisomycin+H2O2組比較，P＜0.05

組別劑量/（μmol/L）凋亡率/%對(duì)照組 - 13.52±0.36 Anisomycin+H2O2 - 47.35±0.64 Anisomycin+Que+H2O2 60 42.36±0.53?Anisomycin+Que+H2O2 90 38.32±0.30?Anisomycin+Que+H2O2 120 35.78±0.54?

圖8 JNK激動(dòng)劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響

3 討論

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）最早由ASAHARA[5]分選出來(lái)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，EPCs在周?chē)懿∽兯碌娜毖M織和心肌梗死區(qū)的血管新生和血管形成中發(fā)揮著重要的作用。CAROLINE博士的小組對(duì)43名正常受試者、44名穩(wěn)定性心絞痛患者以及33名急性冠脈綜合癥患者進(jìn)行10個(gè)月的隨訪(fǎng)后指出冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，形成集落數(shù)，細(xì)胞增殖能力明顯降低。EPCs數(shù)量和功能受損可導(dǎo)致內(nèi)皮損傷與修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡破壞，其數(shù)量減少是預(yù)示動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展的獨(dú)立因素[6]。

目前，Que類(lèi)藥物正在成為預(yù)防和治療冠心病的手段之一。研究表明，Que的攝入量與冠心病的發(fā)病率和死亡率呈負(fù)相關(guān)[7]，Que的內(nèi)皮保護(hù)作用可能與抗氧化及抑制炎癥介質(zhì)的作用有關(guān)，Que可以作用于NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）而起抗炎作用，保護(hù)內(nèi)皮的完整性；Que可以抑制COX-2而起抗炎作用；Que通過(guò)抑制單核細(xì)胞對(duì)血管壁的黏附而起到抗炎保護(hù)內(nèi)皮的作用。此外，還有研究表明Que能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生肥大。Que具有內(nèi)皮保護(hù)作用，但Que對(duì)EPCs功能的影響目前尚無(wú)相關(guān)研究。以往研究發(fā)現(xiàn)，Que可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)遭受H2O2等氧化刺激因子的正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Que可通過(guò)阻斷JNK及ERK兩條途徑達(dá)到抑制凋亡的發(fā)生[8]。H2O2誘導(dǎo)EPCs凋亡與氧化還原信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[9]，200μmol/L H2O2可使凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）活化，P38和JNK表達(dá)增加，EPCs凋亡增多[10]，而 500μmol/L H2O2可造成EPCs的氧化應(yīng)激損傷模型[11]。Que可通過(guò)JNK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，而H2O2誘導(dǎo)EPCs氧化損傷使JNK活化增加，EPCs凋亡增多。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)Que能否直接影響EPCs數(shù)量和功能的研究。

在本研究中，WST-1結(jié)果示：H2O2組EPCs較正常對(duì)照組增殖能力明顯降低，加入60～120μmol/L的Que處理后，H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細(xì)胞增殖能力得到明顯改善，且具有明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)性。而在基礎(chǔ)狀態(tài)下，60～90μmol/L的Que處理的EPCs較正常對(duì)照組增殖，而120μmol/L的Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用?？梢?jiàn)Que對(duì)不同狀態(tài)的EPCs作用是不同的，對(duì)于不同狀態(tài)的EPCs需要尋找最佳的Que濃度。具體機(jī)制尚不清楚，可能與高濃度（通常在100μmol/L以上）的Que產(chǎn)生的細(xì)胞毒性有關(guān)。H2O2作為活性氧可促進(jìn)大量氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞功能、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡，Que（60～120μmol/L）和H2O2共同干預(yù)組與 H2O2組比較能顯著改善氧化應(yīng)激條件下EPCs增殖功能的抑制，減少EPCs的凋亡，且具有濃度依賴(lài)性，這與之前報(bào)道的Que呈劑量依賴(lài)性的促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的結(jié)果較一致[12]。但更高濃度的槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激條件下EPCs增殖和凋亡的影響還有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究還顯示Que在60～120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加，抗H2O2誘導(dǎo)損傷的EPCs凋亡作用均逐漸增強(qiáng)。有學(xué)者認(rèn)為H2O2可使凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）活化，P38和JNK表達(dá)增加，H2O2是誘導(dǎo)者，JNK是氧化損傷的維持因子。本研究中通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)H2O2組p-JNK蛋白表達(dá)明顯高于其它實(shí)驗(yàn)組，這可能與H2O2使EPCs的ASK1活化增加，導(dǎo)致JNK的持續(xù)激活從而使EPCs凋亡增多有關(guān)。Que能夠抑制加入JNK激動(dòng)劑后EPCs凋亡率的增加，且免疫組化顯示加入Que后p-JNK陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物減少，推測(cè)Que對(duì)EPCs氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用除了與其抗炎、抗氧化、清除氧自由基有關(guān)外，還可能通過(guò)JNK信號(hào)通路抑制EPCs凋亡。MA[13]等報(bào)道氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可通過(guò)Akt/eNOS途徑引起EPCs的凋亡，oxLDL通過(guò)下調(diào)Akt的磷酸化水平來(lái)抑制其下游eNOS的活性并使其表達(dá)水平降低，導(dǎo)致NO產(chǎn)量減少，從而引起EPCs的凋亡。而他汀類(lèi)藥物促進(jìn)EPCs動(dòng)員和改善其功能的分子機(jī)制與PI3K-Akt依賴(lài)的eNOS活化有關(guān)。研究表明Que可保護(hù)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及修復(fù)，其作用可能與NO水平有關(guān)[14]，而NO由NO合酶（NOS）催化而形成，Que的抗EPCs凋亡的作用機(jī)制是否與Akt/eNOS信號(hào)通路是是下一步研究探討的重點(diǎn)。

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