邱有波，謝少華，楊拯，袁夢郎，李禹呈，江明禮，曹德琦，席麗，張曉

糖尿病周圍神經(jīng)病(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)主要的慢性并發(fā)癥之一。DPN的發(fā)病機(jī)制是多因素共同作用的結(jié)果。線粒體電子傳遞鏈過氧化物產(chǎn)生過量，是高血糖導(dǎo)致血管損傷的共同機(jī)制，其核心是高糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，引發(fā)組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致糖尿病的各種慢性并發(fā)癥[1]。大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激在DPN中發(fā)揮重要作用，并與多種代謝途徑異常相關(guān)[2]。

電針療法是針刺與電刺激相結(jié)合的一種治療方法，簡單易行，可使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生有效極化，使神經(jīng)細(xì)胞的各種酶類活動性增加，軸突運(yùn)輸加強(qiáng)，代謝旺盛，有利于再生。電針治療大鼠DPN可以提高血清超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)的活性，降低丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量，提高坐骨神經(jīng)運(yùn)動傳導(dǎo)速度，從而有效治療DPN[3-4]。依達(dá)拉奉不僅可有效捕捉、清除自由基，還能抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性，降低氧自由基的濃度，并抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡；通過清除活性氧抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5-6]。本研究觀察電針聯(lián)合依達(dá)拉奉對DPN坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素：SIGMA公司；依達(dá)拉奉注射液：國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司；MDA試劑盒、SOD試劑盒：南京建成生物工程研究所。SDZ-IV型電針治療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；血糖測定儀：長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司；BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，電熱恒溫水浴箱：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 清潔級健康成年SD大鼠60只，雌雄不拘，體重(230±10)g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，禁食12 h后，50只腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg；72 h后尾靜脈采血，血糖≥15 mmol/L確定為糖尿病模型；另10只大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(正常組)。造模后繼續(xù)飼養(yǎng)4周后，以空腹血糖≥15 mmol/L、坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢、擺尾溫度閾值升高作為實(shí)驗(yàn)性DPN大鼠模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。在確認(rèn)實(shí)驗(yàn)性DPN大鼠模型成功的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)數(shù)字表法取出48只大鼠，分為電針組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合組和模型組，每組12只。

1.2.2 治療方法 ①電針組：將大鼠固定，取腎俞(雙)、足三里(雙)穴，針刺0.5 cm，接電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度以刺激部位皮肌微顫為度，20 min/次，隔日1次，共12次；②依達(dá)拉奉組：每日腹腔注射依達(dá)拉奉3 mg/kg，共4周；③聯(lián)合組：在電針治療基礎(chǔ)上每日腹腔注射依達(dá)拉奉3 mg/kg，共4周；④模型組：與電針組相同時間的固定，腹腔注射與依達(dá)拉奉組等量的生理鹽水；⑤正常組：與電針組相同的固定和腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.3 擺尾閾值檢測 分別于造模前，造模后4周、8周，將大鼠固定在大鼠固定器內(nèi)，露出鼠尾，尾部下1/5置于恒溫加熱水浴箱內(nèi)。初始水溫35℃，以2℃/min的速度加熱。記錄鼠尾抬離水面的溫度即為擺尾溫度閾值(TTT)。

1.2.4 神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測 分別于造模后4周、8周，大鼠仰臥位固定，1.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。沿左大腿內(nèi)側(cè)縱向切口，顯露分離坐骨神經(jīng)干。將刺激電極和引導(dǎo)電極分別置于神經(jīng)近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端。應(yīng)用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定大鼠坐骨神經(jīng)動作電位，計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.2.5 血清SOD和MDA檢測 分別于造模后4周、8周經(jīng)右心室采血3 ml，3000 r/min離心15 min，取上清，存于-20℃冰箱。1周內(nèi)，用SOD和MDA測定試劑盒分別測定血清中SOD活性和MDA濃度。操作方法按試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 血糖、體重、TTT 各組大鼠造模前血糖、體重、TTT之間無顯著性差異(P＞0.05)。造模后，各造模組血糖及TTT升高(P＜0.05)，體重降低(P＜0.05)。電針組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合組和模型組之間，血糖、體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。造模8周后，聯(lián)合組大鼠TTT低于電針組與依達(dá)拉奉組(P＜0.05)。見表1～表3。

表1 各組大鼠造模前后血糖比較(mmol/L)

表2 各組大鼠造模前后體重比較(g)

表3 各組大鼠造模前后TTT比較(℃)

2.2 神經(jīng)傳導(dǎo)速度 造模4周后，電針組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合組和模型組神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯低于正常組(P＜0.01)。造模8周后，電針組、依達(dá)拉奉組和聯(lián)合組神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯高于模型組(P＜0.01)；聯(lián)合組神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯高于電針組和依達(dá)拉奉組(P＜0.01)。見表4。

表4 各組大鼠造模前后神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(m/s)

2.3 血清SOD和MDA 造模后，電針組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合組和模型組SOD活性降低(P＜0.01)，MDA濃度升高。造模后4周，電針組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合組和模型組SOD活性和MDA濃度均無顯著性差異(P＞0.05)。造模8周后，電針組、依達(dá)拉奉組和聯(lián)合組后SOD活性明顯升高(P＜0.01)，MDA濃度明顯降低(P＜0.01)；聯(lián)合組優(yōu)于電針組和依達(dá)拉奉組(P＜0.01)。見表5、表6。

3 討論

糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組代謝異常綜合征，其患病率正在迅速升高。長期糖尿病可引起多個系統(tǒng)器官的慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致殘疾和死亡。其中，約半數(shù)以上患者并發(fā)DPN，是非創(chuàng)傷性截肢的主要原因。

表5 各組大鼠造模前后SOD活性比較(U/ml)

表6 各組大鼠造模前后MDA濃度比較(nmol/ml)

DPN是糖尿病微血管并發(fā)癥，與其他微血管并發(fā)癥有著共同的發(fā)病機(jī)制。經(jīng)過近半個世紀(jì)的深入研究，先后發(fā)現(xiàn)多元醇途徑、高級糖基化終末代謝產(chǎn)物蓄積、蛋白激酶C激活、己糖胺途徑等代謝異常在DPN的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。近年來，一些學(xué)者提出，以上4種機(jī)制均與高血糖時，機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高密切相關(guān)。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，無論體內(nèi)體外，高糖均可引起氧化應(yīng)激水平升高。氧化應(yīng)激水平的升高可激活蛋白激酶C通路、多元醇通路、己糖胺通路及終末糖基化產(chǎn)物形成，并激活核因子(NF)-κB上調(diào)黏附分子及炎性因子基因表達(dá)。線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生過多活性氧簇是高血糖激活各條通路引起組織損傷的重要環(huán)節(jié)[7]。依達(dá)拉奉作為一種自由基清除劑，具有良好的抗氧化作用，可在一定程度上改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕周圍神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能損傷，對周圍神經(jīng)起到一定的保護(hù)和治療作用；電針腎俞與足三里兩穴可增加DPN大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)表達(dá)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)的修復(fù)，提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

MDA及SOD是自由基損傷和酶促、非酶促系統(tǒng)清除自由基作用的敏感指標(biāo)[8]。MDA作為自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，裂解生成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，能較好地反映脂質(zhì)過氧化水平，間接反映細(xì)胞損傷程度[9]。SOD是體內(nèi)氧自由基的清除劑之一，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它通過催化消除超氧陰離子自由基，阻礙活性氧的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞的正常功能[10]。測定SOD活性可間接反映體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和毒物對細(xì)胞的損傷情況，亦可反應(yīng)組織內(nèi)清除自由基的能力。

故研究顯示，電針和依達(dá)拉奉均能夠降低DPN大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)其降低氧化應(yīng)激水平的療效。

神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測定對于病變位于脊髓后神經(jīng)根、周圍神經(jīng)、肌肉或神經(jīng)末梢的診斷具有確定意義。DPN患者運(yùn)動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢是其最早的特征，下肢較上肢、遠(yuǎn)端較近端更為明顯。糖尿病患者發(fā)生神經(jīng)病變時，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢通常被作為一個靈敏的指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)性DPN研究中也發(fā)現(xiàn)，鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，在糖尿病早期坐骨神經(jīng)運(yùn)動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著減慢，隨病程延長進(jìn)一步減慢[11]。本研究顯示，電針、依達(dá)拉奉對改善DPN的神經(jīng)傳導(dǎo)速度具有一定作用，聯(lián)合使用能夠增強(qiáng)療效。

TTT主要代表無髓纖維和小的有髓纖維的功能[12]。糖尿病時大鼠溫度刺激閾值增高。本研究顯示，電針及依達(dá)拉奉能夠降低DPN大鼠TTT，聯(lián)合應(yīng)用效果更優(yōu)。

綜上所述，糖尿病大鼠早期即并發(fā)神經(jīng)病變，損傷程度隨病程延長而加重。糖尿病4周大鼠已有明顯的神經(jīng)功能障礙，并存在顯著的氧化應(yīng)激。電針和依達(dá)拉奉均能提高糖尿病大鼠血清SOD的活性，降低MDA的含量，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度，具有良好的防治DPN的作用。聯(lián)合應(yīng)用療效更優(yōu)。

[1]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625.

[2]Feldman EL.Oxidative stress and diabetic neuropathy:a new understanding of an old problem[J].J Clin Invest,2003,111(4):431-433.

[3]李永方,李尚麗,郭秀英,等.電針對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠相關(guān)生化代謝的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2005,27(9):574-575.

[4]張秋娟,施茵,張?jiān)圃?等.電針對實(shí)驗(yàn)性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,(16):3069-3073.

[5]Tomatsuri N,Yoshida N,Takagi T,et al.Edaravone,a newly developed radical scavenger,protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats[J].Int J Mol Med,2004,13(1):105-109.

[6]Ohta S,Iwashita Y,Takada H,et al.Neuroprotection and enhanced recovery with edaravone after acute spinal cord injury in rats[J].Spine,2005,30(10):1154-1158.

[7]Nishikawa T,Edelstein D,Du XL.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J].Nature,2000,404(6779):787-790.

[8]Nair N,Bedwal S,Prasad S,et al.Short term zinc deficiency in diet induces increased oxidative stress in testes and epididymis of rats[J].Indian J Exp Biol,2005,43(9):786-794.

[9]Gawel S,Wardas M,Niedworok E,et al.Malondialdehyde(MDA)as a lipid peroxidation marker[J].Wiad Lek,2004,57(9-10):453-455.

[10]Bailey MA,Ingram MJ,Naughton DP.A novel anti-oxidant and anti-cancer strategy:a peptoid anti-inflammatory drug conjugate with SOD mimic activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,317(4):1155-1158.

[11]Lauria G,Lombardi R,Borgna M,et al.Intraepidermal nerve fiber density in rat foot pad:neuropathologic-neurophysiologic correlation[J].J Peripher Nerv Syst,2005,10(2):202-208.

[12]Apfel SC.Neurotrophic factors in the therapy of diabetic neuropathy[J].Am J Med,1999,107(2B):34S-42S.