彭 華 馬 珊 董 玉 卜文超 馬素紅

長(zhǎng)期、低強(qiáng)度、間歇性的陽(yáng)光輻射以及眼科常用診療器械的強(qiáng)光源照射都可造成視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷，這類損傷可能是年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病的基本病理過(guò)程〔1〕。研究防治視網(wǎng)膜光損傷藥物具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，本文旨在通過(guò)建立視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型，予復(fù)方光明膠囊干預(yù)，為防治視網(wǎng)膜光損傷及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠30只，雌雄不限，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，平均鼠齡3個(gè)月，體重為180～220 g，實(shí)驗(yàn)前檢查雙眼眼前節(jié)及眼底均未見異常。購(gòu)回后，于解放軍昆明總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心馴養(yǎng)1周，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組。每組6只動(dòng)物，12只眼。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件均參照國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定執(zhí)行，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要儀器及用品

手術(shù)顯微鏡（日本高木，型號(hào)：OM-10）；視覺電生理學(xué)檢測(cè)儀（重慶艾爾曦醫(yī)療設(shè)備有限公司，ⅠVE-205A型）；戊巴比妥鈉注射液（由中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20080816）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（美多麗，規(guī)格10 ml，日本參天制藥生產(chǎn)，批號(hào)MP1159）；復(fù)方光明膠囊（云南省藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)云南省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)：滇藥制劑〔2002〕第 468 號(hào)）。

1.3 造模及給藥

造模前先將所有SD大鼠以戊巴比妥鈉注射液行腹腔內(nèi)注射麻醉，用藥劑量為30 mg/kg體重，并予復(fù)方托吡卡胺滴眼液行雙眼散瞳處理，麻醉及散瞳生效后，將大鼠置于手術(shù)顯微鏡光源下，距角膜（150±3）mm照射，固定眼位，分別對(duì)左右眼持續(xù)照射 1 h，照度為（22 000±1 000） lx（ST-Ⅲ型光度計(jì)測(cè)定），造模實(shí)驗(yàn)室室溫維持在21～24℃，造模24 h內(nèi)過(guò)量麻醉處死大鼠并摘取眼球，透射電鏡觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜外核層變薄，光感受器視桿細(xì)胞排列紊亂，膜盤疊狀結(jié)構(gòu)解離，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，可見空泡樣改變。外核層細(xì)胞分布不均勻等改變，成功獲得視網(wǎng)膜光損傷模型（圖1），與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)果相符〔2-3〕。 隨后，將所有大鼠暗適應(yīng) 24 h〔4〕。

分組給藥：①正常對(duì)照組，生理鹽水2 ml/100 g灌胃，每日1次；②模型對(duì)照組，生理鹽水2 ml/100 g灌胃，每日1次；③各治療組予復(fù)方光明膠囊混濁液灌胃，低劑量治療組（2ml/100g，1mg/ml）、中劑量治療組（2 ml/100 g，2 mg/ml）、高劑量治療組（2 ml/100 g，3 mg/ml）均為每日1次。給藥量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算公式[人劑量（mg/kg）×0.018]計(jì)算得。造模后連續(xù)灌胃給藥2周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 閃光視網(wǎng)膜電圖（flash electroretinogram，F(xiàn)-ERG）檢測(cè)方法

以復(fù)方托品酰胺充分散大瞳孔，30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射全麻。充分散瞳并施行全麻后，暗適應(yīng)30 min，各組大鼠被固定在自制實(shí)驗(yàn)板上，將記錄電極，參考電極和接地電極，接在電極線上，分別插入角膜實(shí)質(zhì)層與額前皮膚和身后皮膚中，以APS-2000型視覺電生理檢測(cè)儀檢測(cè)，分別記錄各時(shí)期ERG a、b波波幅。以上過(guò)程全部在暗室紅燈光下進(jìn)行。刺激及記錄條件：采用全視野刺激球白色閃光刺激，閃光強(qiáng)度 1.6 cd·s·m-2，單次刺激，間隔 5 s，共刺激8次，單通道記錄，通頻帶為0.1～500 Hz，每次采樣時(shí)間250 ms，每個(gè)測(cè)定眼至少測(cè)量3次，每次間隔時(shí)間20 s。對(duì)F-ERG的a波和b波振幅進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間兩兩比較用One-Way ANOAY方差分析（LSD法）。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜電圖a、b波振幅均較模型對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)方光明膠囊高、中、低劑量組a、b波振幅值均較模型組有不同程度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組a、b波振幅值較低、中劑量組振幅值高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠 F-ERG a、b 波振幅值的比較（±s，μV）

表1 各組大鼠 F-ERG a、b 波振幅值的比較（±s，μV）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05，④P＞0.05；⑤與中劑量組比較，P＞0.05。

組別 眼數(shù)/只 a波振幅 b波振幅正常對(duì)照組 12 146.38±31.17 435.86±77.34視網(wǎng)膜光損傷模型對(duì)照組 12 66.57±21.67① 259.93±65.99①?gòu)?fù)方光明膠囊低劑量治療組 12 88.27±21.87①② 320.15±56.98①②復(fù)方光明膠囊中劑量治療組12 108.51±20.33①②③ 361.22±62.35①②④復(fù)方光明膠囊高劑量治療組12 116.47±23.18①②③⑤ 377.98±66.68①②③⑤F 18.878 11.826 P 0.000 0.000

3 討論

光是人們感受外界物體、產(chǎn)生視覺信息的必要來(lái)源，但過(guò)強(qiáng)的光照射會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜等組織的損傷。不同波長(zhǎng)的光對(duì)視網(wǎng)膜組織的損傷機(jī)制不同，主要有熱損傷、機(jī)械損傷和光化學(xué)損傷，其中光化學(xué)損傷是最常見的類型〔5〕。本實(shí)驗(yàn)采用照度為（22 000±1 000）lx的致傷光源水平位照射，光照前給予開瞼及散瞳，旨在模擬較強(qiáng)可見光及眼科光學(xué)診療器械光源使用時(shí)的情況。采用手術(shù)顯微鏡光源作為致傷光源，是因其熱效應(yīng)低，對(duì)動(dòng)物全身影響小，可以較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)照射，從而建立良好的動(dòng)物模型。動(dòng)物視網(wǎng)膜光損傷的易感性因種屬而異，鼠類為常用醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其建立視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型操作方便且方法成熟，最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即為SD大鼠和BALB/C 小鼠〔6〕。

ERG是評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能的客觀檢查方法，廣泛應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜損害疾病的臨床和科學(xué)研究中。ERG的a波反映視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的電活動(dòng)，b波集中反映視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的電活動(dòng)；另外，視網(wǎng)膜各層，特別是內(nèi)顆粒細(xì)胞層所有細(xì)胞（水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞等）都參與b波的形成〔7-8〕。因此ERG的b波基本上可以代表視網(wǎng)膜的功能狀態(tài)，b波振幅是視網(wǎng)膜功能的常用測(cè)量參數(shù)。

視網(wǎng)膜光損傷根據(jù)其臨床表現(xiàn)屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“視瞻昏渺”等范疇，《審視瑤函》謂：“此癥謂目?jī)?nèi)外無(wú)癥候，但自視昏渺蒙昧不清也。有神勞，有血少，有元?dú)馊?，有元精虧。而昏渺者，若人年五十以外而昏者，雖治不復(fù)光明。其時(shí)猶月之過(guò)望，天真日衰，自然目光漸衰，不知一無(wú)還返之道，雖妙藥難回，故曰不復(fù)愈矣”。該病病因復(fù)雜，臨床觀察患者多伴有有目絡(luò)瘀滯的表現(xiàn)，因此本課題采用復(fù)方光明膠囊活血化瘀，通絡(luò)明目，探討其改善大鼠視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)理。復(fù)方光明膠囊是我省眼科名老中醫(yī)蘇藩主任在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的院內(nèi)制劑，藥物組成以血竭為君藥，水蛭、土鱉蟲、川芎為臣，地龍為佐，冰片為使，具有活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，通絡(luò)明目等作用，臨床應(yīng)用近20年，深受廣大患者的歡迎。對(duì)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞、老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病具有較為肯定的治療效果〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠視網(wǎng)膜電鏡結(jié)構(gòu)異常，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組ERG a、b波振幅比較差異明顯（P＜0.05），說(shuō)明視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型建立成功。給藥后，復(fù)方光明膠囊高、中、低劑量組ERG a、b波振幅值均較模型組有不同程度增加（P＜0.05），其中高劑量組a、b波的振幅提高最明顯，與低、中劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P＜0.05）。說(shuō)明復(fù)方光明膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜光損傷后閃光視網(wǎng)膜電圖中a、b波振幅的降低有保護(hù)作用，但其藥物劑量的相關(guān)性及其作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

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