林述琨 王耀鵬 溫吉海

1.大連普蘭店市中心醫(yī)院病理科； 2.普蘭店市中心醫(yī)院肺外科

MicroRNAs(miRNA)是一類長約19～25bp的單鏈非編碼小分子RNA，能夠與靶 基因mRNA的3UTR以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上引起靶基因mRNAs發(fā)生降解或翻譯抑制[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有類似癌基因或抑癌基因的作用[3,4]。

研究報(bào)道m(xù)iR-214可能參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[5-8]；本研究發(fā)現(xiàn)miR-214在肺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁肺組織，同時(shí)我們構(gòu)建了miR-214的真核表達(dá)載體，并通過雙熒光素酶報(bào)告分析和Western blot方法探討miR-214對靶基因的調(diào)控作用。從而為研 究miR-214在肺癌中作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞株A549，用含有10%新生牛血清，100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Real-time PCR用Trizol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Takara)。miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTG CC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GGA CAG CAG GCA CAG ACA -3′，下游引物5′- CAG TGC AGG GTC CGA GGT -3′。以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進(jìn)行反應(yīng)，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個(gè)循環(huán)。以2 值比較兩者之間的差異。每組重復(fù)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 miR-214質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù) miR-214前體在GenBank中的序列，設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列為：Forward：5'- AAGCTTCTGTTACGCAAATTATCCATGTT -3'，Reverse：5'- CTCGAGAATGGGTTTTATTATATTTCATA-3'，目的片段亞克隆到pCDNA3.1(+)上，經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-miR-214 能夠過表達(dá)成熟的miR-214。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件對miR-214進(jìn)行靶基因預(yù)測，選β-catenin為候選靶基因，PCR擴(kuò)增包括miR-214結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的β-catenin 3'UTR區(qū)，引物序列為：Forward：5'-AAT TGTAATCTGAATAAAGTGTAACAAT-3'，Reverse：5'-ATGAATTAAAAGTTTAATTCTGAACCAT-3'(引入SacI和XhoI 酶切位點(diǎn)，)， 目的片段亞克隆到 pMIR載體螢火蟲熒光素基因的下游，重組載體命名為pMIR-β-catenin。對pMIR-β-catenin重組質(zhì)?！胺N子區(qū)”進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后的質(zhì)粒命名為pMIR-βcatenin-Mut。所有構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒均經(jīng)雙酶切和測序鑒定。A549細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組為：pCDNA 3.1(+)-miR- 214+pMIR-β-catenin組、pCDNA3.1(+)+pMIR-β-catenin、pCDNA3.1(+)-miR- 214+pMIR-β-catenin-Mut組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入裂解液(100μl/孔)，離心并收集上清至96孔板中，每孔中加入40μl 螢火蟲熒光素酶底物，混勻10s后檢測熒光強(qiáng)度；然后再加入40μl海腎熒光素酶底物，混勻10s后檢測熒光強(qiáng)度。將螢火蟲熒光素強(qiáng)度值/海腎熒光素強(qiáng)度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.5 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(dá)水平，用RIPA細(xì)胞裂解液(含有0.1%的PMSF)冰上裂解細(xì)胞20min，收集于1.5ml EP管中，離心后上清液轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白在SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉4℃過夜封閉，用β-catenin的兔抗人單克隆一抗(1:1000)室溫下孵育2 h(cell signaling 9581)，再用過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫下孵育2h，以β-actin為內(nèi)參，用Bandscan 5.0軟件分析蛋白條帶總灰度值，檢測表達(dá)差異。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-214在肺癌組織中的表達(dá)情況為了驗(yàn)證miR-214在肺癌中的表達(dá)情況，我們應(yīng)用real-time PCR檢測了5對肺癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織中miR-214的表達(dá)。結(jié)果顯示，肺癌組織較癌旁肺組織miR-214明顯低表達(dá)，見圖1。

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測β-catenin是miR-214的靶基因應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件 TargetScan對miR-214的靶基因進(jìn)行預(yù)測，分析顯示在β-catenin的3'UTR 區(qū)有7 個(gè)堿基與β-catenin 的“種子區(qū)”完全互補(bǔ)配對(見圖2)，因此生物信息學(xué)預(yù)測認(rèn)為β-catenin可能是miR-214的靶基因。

圖1 Real-time PCR方法檢測miR-214的表達(dá)

圖2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-214的靶基因

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-214對β-catenin的調(diào)控作用將重組表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-214和融合β-catenin 3'UTR 的表達(dá)質(zhì)粒pMIR-β-catenin共轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后熒光素酶活性表達(dá)受到明顯的抑制，而轉(zhuǎn)染空載體pCDNA 3.1 和融合基因β-catenin'UTR的表達(dá)質(zhì)粒pMIR-Aβ-catenin的熒光素酶活性無明顯的變化；同樣，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-214和融合β-catenin 3'UTR“種 子 區(qū) ”突 變 的 表 達(dá) 質(zhì) 粒pMIR-β-catenin-Mut 共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后熒光素酶活性沒有受到抑制，與對照組轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1和融合基因β-catenin 3'UTR 的表達(dá)質(zhì)粒的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。結(jié)果表明miR-214 能夠?qū)θ甩?catenin 3'UTR 區(qū)起到抑制性的調(diào)控作用。

2.4 Western blot檢測miR-214抑制內(nèi)源β-catenin蛋白表達(dá) pCDNA 3.1-miR-214轉(zhuǎn)染組中β-catenin蛋白表達(dá)與空白對照組(mock)和空載體轉(zhuǎn)染組(pCDNA 3.1)中β-catenin蛋白表達(dá)差異明顯，β-catenin在pCDNA 3.1-miR-214轉(zhuǎn)染組中表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)果表明miR-214能夠在翻譯水平上抑制β-catenin蛋白表達(dá)。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-214對β-catenin的調(diào)控

圖4 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(dá)。1-空白對照組(mock)；2-空載體轉(zhuǎn)染組(pCDNA 3.1)；3-pCDNA 3.1-miR-214轉(zhuǎn)染組

3 討論

目前，miRNA是現(xiàn)今腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，miRNA可以與多種靶基因結(jié)合在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可起到癌基因或抑癌基因作用[3,4]。研究報(bào)道m(xù)iR-214可以抑制肝癌、宮頸癌和乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[5-8]，起到抑癌基因作用。而目前miR-214在肺癌中的作用未見報(bào)道，現(xiàn)就miR-214在肺癌中的表達(dá)及靶基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

我們首先檢測了肺癌和癌旁組織中miR-214的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-214在肺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，miR-214可能作為抑癌基因參與肺癌的發(fā)生。進(jìn)一步我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測β-catenin可能是miR-214的靶基因，本研究首先通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-214對的β-catenin的3'UTR 區(qū)具有作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在A549細(xì)胞中通過Western blot 方法證實(shí)了miR-214 對β-catenin的表達(dá)具有抑制作用。已有研究表明β-catenin的表達(dá)與肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)[9,10]。因此，本研究對深入探討miR-214 對β-catenin表達(dá)抑制作用的作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究miR-214在肺癌中的作用提供了思路和治療的靶點(diǎn)。

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