李 峰，尚 磊，俞力超，徐秀泉

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001;2江蘇大學(xué)京江學(xué)院;3江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013

響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌總酚的超聲提取工藝

李 峰1，尚 磊2，俞力超1，徐秀泉3*

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001;2江蘇大學(xué)京江學(xué)院;3江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013

以樺褐孔菌總酚得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法對(duì)超聲提取過程中影響總酚得率的乙醇濃度、超聲溫度及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明樺褐孔菌總酚超聲提取的最佳工藝條件為:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超聲提取40 min，在此最佳條件下，總酚得率為19.42 mg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相符，相對(duì)誤差為+0.78%。

樺褐孔菌;總酚;超聲提取;響應(yīng)面設(shè)計(jì)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)，又稱chaga，從16世紀(jì)以來(lái)就是俄羅斯、東歐、波蘭、芬蘭等國(guó)家民間廣泛應(yīng)用的藥用真菌，用于防治各種疑難雜癥，日本研究人員高度評(píng)價(jià)這種民間藥用真菌為“萬(wàn)能藥”［1］。樺褐孔菌中主要含有多糖、酚類及三萜類化合物，其中酚類化合物是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種藥理活性［2-5］。但對(duì)樺褐孔菌總酚的提取工藝研究較少。響應(yīng)面法(response surfacemethodology，RSM)是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將多因子實(shí)驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系［6］。為深入開發(fā)該藥用真菌，本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方法，響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌總酚的超聲提取工藝條件，為樺褐孔菌的深入開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，DHG-9145鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ—250DB型超聲波儀(昆明市超聲儀器有限公司)，BS 110 S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。沒食子酸對(duì)照品，F(xiàn)olin-Ciocaltean試劑購(gòu)自Sigma公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭搴挚拙?gòu)自吉林省千百匯土特產(chǎn)有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院宋晶博士鑒定為藥用真菌Inonotus obliquus干燥菌核，粉碎過篩備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總酚的測(cè)定［7］

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取沒食子酸對(duì)照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇適量溶解，定容至刻度，搖勻，取上述溶液2.5 mL定容至25 mL量瓶中，即得100 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入Folin-Ciocaltean試劑0.5 mL，振搖1 min，再加入20%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，加蒸餾水至刻度，在室溫放置2小時(shí)。以相應(yīng)的試劑溶液為空白，按分光光度法，在750 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A= 0.0147C-0.0017，R2=0.9994，結(jié)果表明沒食子酸在濃度10～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1.00 g樺褐孔菌粉末于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，在規(guī)定溫度下超聲提取規(guī)定時(shí)間，離心，定容至25 mL得樣品溶液，移取樣品溶液適量按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總酚得率。

采用單因素試驗(yàn)考察乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比對(duì)樺褐孔菌總酚提取率的影響，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定因素水平范圍，利用Design-Expert Software軟件為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對(duì)總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間20 min，考察不同乙醇濃度對(duì)樺褐孔菌總酚提取率的影響。結(jié)果表明在20%～60%乙醇濃度范圍內(nèi)，總酚提取率隨乙醇濃度的增加而有顯著提高，在乙醇濃度60%時(shí)提取率最大，隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增加，總酚提取率顯著下降。因此選擇60%左右乙醇作為較佳的提取溶劑。

3.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，超聲溫度50℃，乙醇濃度60%，考察不同超聲提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌總酚提取率的影響。結(jié)果表明從10到30 min總酚提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在30 min時(shí)達(dá)到最大值。再延長(zhǎng)超聲時(shí)間，總酚得率趨于平穩(wěn)，有下降的趨勢(shì)，因此選擇超聲時(shí)間在30 min左右為宜。

3.1.3 超聲提取溫度對(duì)總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，乙醇濃度60%，超聲時(shí)間20 min，分別在考察不同超聲溫度對(duì)樺褐孔菌總酚提取率的影響。結(jié)果表明在20～50℃范圍內(nèi)，隨溫度提高總酚得率提高，說(shuō)明較高的溫度對(duì)酚化合物的溶出是有利的。當(dāng)超過50℃后，總酚得率有所下降，選擇50℃左右提取較為合適。

3.1.4 料液比對(duì)總酚提取率的影響

固定乙醇濃度60%，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50℃，按照1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入提取溶劑，考察不同料液比對(duì)樺褐孔菌總酚提取率的影響。結(jié)果表明隨料液比的增加，總酚提取率相應(yīng)增高，這是由于溶劑用量增加，可以使藥材與溶劑接觸面積增大，并且能夠增大固液濃度差，有利于擴(kuò)散速度的提高。當(dāng)料液比大于1∶30后，總酚的提取率基本保持不變，本著經(jīng)濟(jì)節(jié)約原則，選擇料液比1∶30為好。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化總酚的超聲提取條件

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲時(shí)間三個(gè)因素為自變量，總酚的提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水平分析選取見表1。實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2，其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in extraction experiments of total phenols

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental designs and extraction results of total phenols

2 －1 1 0 18.45 18.57 3 0 1 1 18.14 18.40 4 －1 0 1 18.35 18.22 5 0 －1 1 18.04 18.24 6 0 0 0 18.64 18.62 7 0 0 0 18.59 18.62 8 －1 0 －1 15.01 15.09 9 －1 －1 0 16.68 16.87 10 0 －1 －1 13.60 13.52 11 0 0 0 18.60 18.62 12 1 1 0 17.42 17.23 13 0 0 0 18.56 18.62 14 1 －1 0 15.21 15.08 15 0 1 －1 17.50 17.30 16 0 0 0 18.72 18.62 17 1 0 －1 14.05 14.18

3.2.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)與樺褐孔菌總酚之間的二次多項(xiàng)回歸方程:

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3回歸方差顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)各因素對(duì)總酚得率的線性效應(yīng)極顯著;二次項(xiàng)各因素對(duì)總酚提取率的曲面效應(yīng)極顯著;比較各因子間交互作用提取時(shí)間和提取溫度間交互作用極顯著，乙醇濃度與提取溫度交互作用高度顯著，乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用不顯著，各因素交互作用的響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖見1-3。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，回歸方程顯著性檢測(cè)P＜0.0001，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.9981，說(shuō)明該模型能解釋99.81%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取工藝提取樺褐孔菌總酚是可行的。

表3 樺褐孔菌總酚提取率方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the regression model and respective terms

3.3 提取工藝條件的確定

為確定各因素的最佳取值，利用Design-Expert軟件分析后，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，(A、B、C)的代碼值為(-0.24、0.97、0.18)。與之對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)值為乙醇濃度(A)=55.2%，提取時(shí)間(B)= 39.7 min，提取溫度(C)=51.8℃，此時(shí)酚提取得率的最大估計(jì)值Y=19.30 mg/g。為實(shí)際操作方便，選取乙醇濃度=55%，提取時(shí)間=40 min，提取溫度=52℃，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，樺褐孔菌總酚得率為 19.42 mg/g，與理論值的相對(duì)偏差為+0.78%說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值與理論值有較好的擬合性。

4 結(jié)論

將單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法結(jié)合對(duì)超聲輔助提取樺褐孔菌總酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超聲提取40 min，在此最佳條件下，總酚得率為19.42 mg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相符。響應(yīng)面分析法可以很好的對(duì)樺褐孔菌總酚超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)藥用真菌樺褐孔菌的深入研究開發(fā)具有很好的理論指導(dǎo)意義。

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7 Wang J，Sun BG，Cao YP，et al.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran.Food Chem，2008，(106):804-808.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Phenols from Inonotus obliquus by Response Surface Methodology

LI Feng1，SHANG Lei2，YU Li-chao1，XU Xiu-quan3*1Affiliated Hospital of Jiangsu University Zhenjiang 212001，China;2School of Jingjiang Jiangsu University;3School of Pharmacy Jiangsu University Zhenjiang 212013，China

With the Extraction rate of total phenols as response value the ethanol concentration ultrasonic-assisted extraction temperature and extraction time were optimized by response surface methodology with 3 factors and 3 levels based on single factor experiments.The optimal extraction conditions were ethanol concentration 55%liquid-material ratio of 1∶30 extraction temperature 52℃ and extraction time 40 min for extraction total phenols from Inonotus obliquus.Under these conditions the maximal yield of total phenols reached 19.42 mg/g which was agreed with model predictions for the relative error of+0.78%.

Inonotus obliquus;total phenols;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

1001-6880(2012)10-1458-05

2011-12-26 接受日期:2012-03-12

鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2010033);江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(Y09A098)

*通訊作者 Tel:86-511-85038403;E-mail:xxq781026@sohu.com

R284.2

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