黃巨波，劉 紅，盧圣樓，張 浩

海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海口571127

神秘果種子蛋白質(zhì)的提取與降糖效用研究

黃巨波，劉 紅*，盧圣樓，張 浩

海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，?？?71127

本文研究神秘果種子蛋白質(zhì)(SDSP)的提取條件及其降糖效用，通過(guò)考察固液比、pH值、時(shí)間和溫度等因素對(duì)SDSP提取率的影響來(lái)優(yōu)化提取蛋白質(zhì)的條件，并利用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型分析神秘果種子蛋白質(zhì)的降糖效果。實(shí)驗(yàn)方法如下:將實(shí)驗(yàn)組小鼠分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、SDSP實(shí)驗(yàn)組(200 mg/kg)和陽(yáng)性對(duì)照組(80 mg/kg二甲雙胍)，灌胃14 d后測(cè)量空腹血糖值(FBG)，胰島素含量和體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SDSP的最佳提取工藝條件為固液比1∶20、pH 8.5、時(shí)間120 min、溫度50℃。測(cè)定SDSP組的FBG含量比模型組降低46%，而胰島素含量則增加約4倍。實(shí)驗(yàn)表明SDSP顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促進(jìn)胰島素的分泌。

神秘果;蛋白質(zhì);四氧嘧啶;降糖效用

神秘果為山欖科(Sapotaceae)神秘屬(Synsepalum)常綠灌木，是一種稀有的種植資源，原產(chǎn)于西非，自然分布在西非剛果一帶，在印度尼西亞的叢林中也有發(fā)現(xiàn)，自20世紀(jì)60年代起先后引入我國(guó)海南、廣東、廣西、福建等省區(qū)種植［1，2］。近期研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)中含有的神秘果素除了能夠改變味覺(jué)外［3，5］，還具有改善胰島素抵抗的功能［4］，說(shuō)明神秘果可作為糖尿病人的輔助治療藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，為進(jìn)一步考察神秘果對(duì)糖尿病的治療作用［6］，本文從神秘果種子中提取蛋白質(zhì)，確定最佳工藝條件，并用提取出的蛋白質(zhì)對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)糖尿病小鼠的降血糖效用［7-9］，為糖尿病治療進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和儀器

新鮮神秘果(海南本地)由海南師范大學(xué)生命科學(xué)院鐘瓊芯副教授鑒定

昆明種♂小鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0020

血糖儀(三諾安穩(wěn))小鼠胰島素試劑盒(南京建成生物工程研究所)四氧嘧啶和牛血清白蛋白(Sigma公司)二甲雙胍(石家莊普力制藥)其余試劑均為分析純

1.2 神秘果種子蛋白質(zhì)(SDSP)的提取

將新鮮的神秘果去除果肉得種子，冷凍干燥、研磨，得神秘果種子粉，用凱氏定氮法測(cè)其蛋白質(zhì)含量［10］。準(zhǔn)確稱(chēng)取神秘果種子粉(2 g左右)于消化瓶中，加入催化劑(K2SO4和CuSO4)，濃H2SO420 mL，消化至呈綠色，冷卻加水定容，用硼酸作吸收液，反應(yīng)室內(nèi)加入濃NaOH，用0.05N HCl滴定。在神秘果種子粉中加入石油醚或環(huán)己烷攪拌脫去其油脂部分，抽濾分離，在去除油脂的種子粉中加入磷酸鹽的緩沖溶液(并加入少量的巰基乙醇和氯化鈉，以防止蛋白質(zhì)變性和有利于蛋白質(zhì)的溶解)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，抽提得到蛋白質(zhì)提取液。取抽提液樣品稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，用考馬斯亮藍(lán)法(即Bradford法)測(cè)定粗提液中蛋白質(zhì)含量［11］，計(jì)算提取率(粗蛋白提取率=粗提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/種子粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量)。

1.3 正交實(shí)驗(yàn)

為確定SDSP的最佳提取條件，設(shè)計(jì)以固液比、pH值、時(shí)間和溫度為條件的L9(34)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，各因素所取條件見(jiàn)表1所示。

表1 SDSP提取正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of extraction of SDSP

1.4 降糖活性研究

1.4.1 建立糖尿病模型

預(yù)選健康♂小鼠40只(20 g左右)，先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，禁食12 h，腹腔注射四氧嘧啶180 mg/ kg，72 h后空腹血糖值12 mmol/L以上為高血糖小鼠，造型成功。

1.4.2 神秘果蛋白對(duì)糖尿病小鼠的降血糖研究

取10只正常小鼠作為(1)空白對(duì)照組，和上述造型成功的高血糖值小鼠30只，按血糖值、體重隨機(jī)分為(2)模型組(蒸餾水)，(3)實(shí)驗(yàn)組(200 mg/kg SDSP)，(4)陽(yáng)性對(duì)照組(80 mg/kg二甲雙胍)，每組10只。小鼠分籠飼養(yǎng)，按劑量灌胃一次/天，空白對(duì)照組和模型組灌蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組灌胃SDSP 200 mg/ kg，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃二甲雙胍80 mg/kg，自由進(jìn)食、飲水，記錄飲水量，測(cè)體重、血糖值/周。實(shí)驗(yàn)第14天，禁食12 h，腹腔注射500 mg/kg葡萄糖，90 min后測(cè)量血液中胰島素含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 神秘果提取條件優(yōu)化

以牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，A595為縱坐標(biāo)作蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，由此可測(cè)得各粗提取液中蛋白質(zhì)含量。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

各組試驗(yàn)神秘果種子蛋白質(zhì)提取率和極差分析結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析可知，以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的影響順序?yàn)?固液比＞溫度＞pH＞時(shí)間，最佳工藝條件為A3B1C3D2。方差分析結(jié)果顯示:固液比F= 1.549和溫度F=1.56＜F(2，8)0.05=4.46，說(shuō)明固液比和溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率都沒(méi)有顯著性影響，即表明在實(shí)驗(yàn)操作條件下溫度40～60℃以及固液比10∶1～20∶1條件下對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著。綜合以上情況考慮，選取A3B1C3D2，即溫度50℃、pH值8.5、固液比1∶20、時(shí)間120 min為最佳提取工藝條件提取SDSP，提取率可達(dá)到80.3%。

為考察上述最佳提取工藝的可操作性和穩(wěn)定性，嚴(yán)格按照工藝條件要求提取SDSP 3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明:按優(yōu)選的最佳工藝條件提取SDSP，提取率較高，且工藝穩(wěn)定。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment of extraction rate

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

2.2 降血糖實(shí)驗(yàn)

模型組小鼠“三多一少”癥狀明顯，并逐漸加重;而實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠癥狀較輕，且逐漸緩解。表4中各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，喂食SDSP的糖尿病實(shí)驗(yàn)組小鼠空腹血糖值較模型組降低，差異顯著(P＜0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血糖值也明顯降低(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的血糖值趨近于正常值，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射葡萄糖后胰島素含量高于模型組，差異顯著(P＜0.01)。較模型組，正常對(duì)照組小鼠體重增加，差異顯著(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體重增加，差異不顯著。

表4 SDSP對(duì)糖尿病小鼠血糖值、胰島素含量和體重的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

表4 SDSP對(duì)糖尿病小鼠血糖值、胰島素含量和體重的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with model group:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

體重(g)組別Group劑量(mg·kg－1) Dosage血糖值(mmol/L) Blood glucose level胰島素含量(mU/L) Insulin content Weight 0 d 7 d 14 d 14 d 0 d 14 d正常對(duì)照組 － 5.8±0.4＊＊ 5.6±0.3＊＊ 5.6±0.2＊＊ 18.3±2.6 21.4±0.5 28.4±0.8＊＊模型組 － 16.5±2.6 15.6±2.9 15.2±3.0 20.6±7.8 20.1±1.1 20.8±1.8實(shí)驗(yàn)組 200 16.2±2.2 13.5±2.6* 8.1±2.4＊＊ 79.5±6.1＊＊ 20.7±0.9 23.2±3.4*陽(yáng)性對(duì)照組 80 16.8±1.8 14.3±2.1* 7.5±2.4＊＊ 25.3±6.6 21.7±1.5 22.2±2.9*

3 討論

現(xiàn)有治療糖尿病的藥物一般是通過(guò)刺激殘存β細(xì)胞的胰島素分泌［12］，或是抑制胰高血糖素分泌，來(lái)降低和控制患者的血糖值，而四氧嘧啶是一種特異性的β細(xì)胞毒劑，可選擇性地?fù)p壞多種動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病。研究糖尿病治療藥物療效的常用動(dòng)物模型為四氧嘧啶糖尿病小鼠。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出提取SDSP的最佳工藝條件為溫度為50℃、pH值為8.5、固液比為1∶20、時(shí)間為120 min。在降血糖實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖值較模型組降低(P＜0.01)，空腹注射葡萄糖后胰島素含量高于模型組(P＜0.01)，說(shuō)明SDSP能有效地降低糖尿病小鼠空腹血糖值和促進(jìn)胰島素的分泌，但其分離純化、降糖機(jī)理等還需進(jìn)一步研究證明。

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Study on Hypoglycemic Activity and Extraction of Synsepalum Dulcificum Seed Protein

HUANG Ju-bo，LIU Hong*，LU Sheng-lou，ZHANG Hao
College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571127，China

To investigate the extraction efficiency and hypoglycemic activity of Synsepalum Dulcificum seed protein(SDSP)，conditions are investigated by the ratio of solid to liquid，pH，time and temperature to get better extract rate，the hypoglycemic activity in diabetic mice induced by intraperitoneal injection of alloxan(180 mg/kg)were done as follows.All the mice were divided into four groups randomly，including normal control group，model group，SDSP group(200 mg/ kg)，metfomin group(80 mg/kg)，weight and fluid intake were monitored every week，fasting blood glucose(FBG)and insulin were measured after 2 weeks.The optimum extracting conditions:ratio of solid to liquid(w∶v)1∶30，pH 8.5，time 120 min，temperature 50℃.Compared with diabetic model group，the levels of FBG were decreased remarkably to 46%and insulin was increased 4 times in the SDSP group.It demonstrated that the SDSP could significantly lower blood glucose and promote the secretion of insulin of diabetic mice.

Synsepalum Dulcificum;protein;alloxan;hypoglycemic

1001-6880(2012)10-1441-04

2012-01-10 接受日期:2012-06-20

海南省社會(huì)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(2010SF007);?？谑兄攸c(diǎn)科技計(jì)劃(2010-086);海南師范大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(JJCG1101);海南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放性項(xiàng)目(KFSY11007)

*通訊作者 E-mail:lhyd123@sohu.com

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