于艷芳，段曉輝，張 勇，張瑞英，賈力品，崔星亮，裴志萍

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 邯鄲056002；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.邯鄲市第二醫(yī)院）

很多原因可以引起腹水，臨床醫(yī)生對腹水性質(zhì)的診斷比較困難。在確定腹水存在后，明確腹水的良性、惡性一直困擾著臨床醫(yī)生，查找到癌細(xì)胞對明確診段的具有重要意義，但其陽性率尚不盡人意。目前，判斷腹水性質(zhì)的報(bào)道很多，方法也不相同。因此，建立新的能診斷腹水良性、惡性的診斷指標(biāo)，對腹水性質(zhì)的判定、疾病診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 選擇2009年10月—2010年12月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院住院確診為惡性腹水的患者60例（均有腹膜轉(zhuǎn)移）作為病例組，男35例，女25例，平均年齡（56±12.5）歲，其中肝癌28例，胃癌10例，卵巢癌13例，結(jié)腸癌8例，胰腺癌1例。選擇同一時(shí)期入院確診為良性腹水75例患者作為對照組，男40例，女35例，平均年齡（50±12）歲，其中肝硬化37例，結(jié)核性腹水18例，心源性腹水8例，低蛋白血癥4例，良性腹膜間皮瘤3例。兩組患者年齡、性別方面比較無顯著性差異（P＞0.05），符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

1.2 主要儀器及試劑 細(xì)胞制片機(jī)為HZ－36A型全自動液基薄層細(xì)胞檢測技術(shù)（TCT）制片機(jī)；羊抗人端粒酶多克隆抗體和鼠抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）多克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司；含兔抗羊二抗和兔抗鼠二抗的SABC試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 檢測方法及結(jié)果判定 確定分組患者后，于入院次晨無菌穿刺腹腔收集腹水150－200ml。在收集腹水前均未接受過任何治療。樣品于4℃加1.077g／ml的細(xì)胞分離液，3 000r／min離心20 min，吸棄上清，PBS重懸沉淀，1 600r／min離心6 min，洗細(xì)胞2次，沉淀物用細(xì)胞保存液重懸加入細(xì)胞保存瓶，置于－80℃保存。采用全自動TCT制片機(jī)制片，免疫細(xì)胞化學(xué)方法SABC檢測VEGF和端粒酶。

1.4 結(jié)果判定 染色結(jié)果為端粒酶定位于腫瘤細(xì)胞核，VEGF位于細(xì)胞胞漿，顏色介于淡黃色－棕褐色，所有染色后圖片均由固定的二位病理醫(yī)師雙盲法閱片。選取細(xì)胞分布均勻區(qū)域準(zhǔn)確計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞染色程度和著色細(xì)胞個(gè)數(shù)。計(jì)分規(guī)則：無色0分，淺色1分，深色2分，計(jì)算每個(gè)樣本總分?jǐn)?shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 11.5軟件繪制受試者工作曲線（ROC曲線），計(jì)算曲線下面積，根據(jù)ROC曲線判斷最佳診斷性能（靈敏度與特異度之和最大）時(shí)候的界值，并計(jì)算陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比和尤登指數(shù)（Youden index，YI）。

2 結(jié)果

2.1 良性、惡性腹水細(xì)胞TCT制片后行SABC細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算其染色得分分布 惡性腹水的VEGF、端粒酶染色結(jié)果均偏向于得分軸的右側(cè)，呈現(xiàn)偏態(tài)分布，以大分值為主；良性腹水細(xì)胞染色結(jié)果呈現(xiàn)正態(tài)分布，且其中位數(shù)明顯小于惡性腹水染色得分中位數(shù)（P＜0.01），見圖1。

圖1 良性、惡性腹水的TCT制片細(xì)胞染色得分分布

2.2 VEGF、端粒酶染色得分值 以確診實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)VEGF、端粒酶染色得分值，以此分值為診斷結(jié)果，數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5軟件，繪制ROC曲線，見圖2。以SPSS反饋數(shù)據(jù)得出最佳陽性判斷界值為VEGF＞300分、端粒酶＞320分為陽性，計(jì)算兩者的診斷性能指標(biāo)，圖2、見表1。

3 討論

惡性腹水是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一種表現(xiàn)，很多非惡性疾病也能引起腹水，如結(jié)核病、肝硬化、低蛋白癥等。鑒別腹水的良性、惡性一直是臨床醫(yī)生困惑的問題。傳統(tǒng)的鑒別腹水性質(zhì)的方法—靈敏度和特異度都不盡人意，雖然直接檢查腹水中的癌細(xì)胞具有診斷意義，但是其陽性率不高，容易漏診。因此，尋求一種高診斷性能的檢驗(yàn)方法鑒別診斷腹水的性質(zhì)顯得尤為重要。

圖2 ROC曲線

表1 根據(jù)ROC曲線計(jì)算各性能指標(biāo)

VEGF是一種促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在惡性腹水的形成中，VEGF扮演著重要的角色［1］，有報(bào)道稱，卵巢癌患者腹水中的VEGF含量明顯高于良性腹水中的含量［2］，說明檢測腹水中VEGF的含量具有鑒別良性、惡性腹水的能力。端粒酶是腫瘤的一個(gè)顯著特征，其高表達(dá)見于各種惡性腫瘤，而正常組織檢測不到有活性的端粒酶。據(jù)國外報(bào)道，98%的腫瘤細(xì)胞系、90%的原發(fā)腫瘤皆表現(xiàn)出端粒酶活性［3］，因此，有人建議用端粒酶來作為惡性腫瘤的標(biāo)志物，其診斷靈敏度和特異性甚至可以達(dá)到90%［4］。VEGF以可溶性細(xì)胞因子的形式存在，并可經(jīng)分泌小泡分泌到細(xì)胞外，而端粒酶則存在于細(xì)胞核內(nèi)部，其活性主要表現(xiàn)為對染色質(zhì)端粒的編輯。

液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)是近些年的一項(xiàng)新技術(shù)，因其在婦科宮頸疾病診斷方面具有獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛青睞［5］。近年來有人將其應(yīng)用于腹水細(xì)胞檢查，并且也得到了很高的診斷符合率，且涂片背景清晰，惡性細(xì)胞容易分辨，細(xì)胞團(tuán)中單個(gè)細(xì)胞界限分明，染色清晰，極大地提高了識別的準(zhǔn)確度［6］。

本研究收集本院確診為惡性腹水和良性腹水患者為研究對象，采取細(xì)胞內(nèi)定位半定量檢測VEGF和端粒酶的表達(dá)。結(jié)果顯示，惡性腹水患者的腹水細(xì)胞VEGF和端粒酶表達(dá)明顯高于良性腹水的二者表達(dá)量（P＜0.05，結(jié)果另文發(fā)表），表達(dá)分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)偏態(tài)分布，分值都比較高。而良性腹水細(xì)胞表現(xiàn)為正態(tài)分布，但是其中位數(shù)要明顯小于惡性腹水分布的中位數(shù)（P＜0.05，結(jié)果另文發(fā)表）。

對本文收集的135例標(biāo)本進(jìn)行SABC細(xì)胞化學(xué)染色，并統(tǒng)計(jì)染色深度評分，繪制ROC曲線顯示，曲線下面積VEGF為0.953，端粒酶為0.957，表明二者具有較高的診斷價(jià)值。以ROC曲線最接近左上角點(diǎn)的值為最佳診斷指標(biāo)判定點(diǎn)，其診斷敏感性VEGF為 0.900，端粒酶為 0.933，診斷特異性VEGF為0.920，端粒酶為0.933。且給出以VEGF為檢測對象的陽性臨界值為300分，端粒酶為320分。此結(jié)果表明，采取本研究方法選擇最佳的陽性臨界值，用VEGF和端粒酶表達(dá)為診斷指標(biāo)鑒別診斷腹水的性質(zhì)，具有很高的診斷正確度。

由此可見，作為一種輔助檢驗(yàn)方法，TCT制片后用細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測判定腹水的良性、惡性具有較好的診斷價(jià)值。在高度懷疑惡性腹水，而細(xì)胞學(xué)檢查陰性，且其他檢查未發(fā)現(xiàn)病變時(shí)，可以對腹水細(xì)胞行VEGF、端粒酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算染色深淺得分，從而對腹水性質(zhì)進(jìn)行判斷。

［1］Neulen J，Yan Z，Raczek S，et al.Human chorionic gonadotropin dependent expression of VEGF／VPF in human granulosa cell：Importance in ovarian hyperstimulation syndrome［J］.J Clin Endocrihol Metab，1995，（80）：1967.

［2］Yamamoto S，Kanishi I，Mandai M，et al.Expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）in epithelial ovarian neoplasms：Correlation with clinicopathology and patient survival，and analysis of serum VEGF levels［J］.Br J Cancer，1997，76（9）：1221.

［3］Kim JL，Piatyxzek MA，Prowse K R，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］.Science，1994，266：2011.

［4］Dahse R，F(xiàn)iedler W，Ernst G.Telomeres and telomerase：biological and clinical importance［J］.Clin Chem，1997，43：708.

［5］潘秦鏡，李凌，喬友林，等.液基細(xì)胞學(xué)篩查宮頸癌的研究［J］.中華腫瘤雜志，2001，23（4）：309.

［6］施海法，血管內(nèi)皮生長因子和端粒酶與惡性腹水的相關(guān)性分析［J］.疑難病雜志，2010，9（6）：448.