楊 陽，馬 嶸，張 遠(yuǎn)，劉郁東，汪 敏，孫圣剛，黎 鋼＊

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢430022；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北 武漢430030）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種漸進(jìn)性大腦退行性病變，是最常見的成年癡呆類型，其發(fā)病率隨年齡增長逐漸升高。迄今確切的病因與發(fā)病機(jī)制尚未充分闡明，尚無有效的根治良策。近年來神經(jīng)鞘脂代謝異常與β淀粉樣蛋白（amyloid beta－protein，Aβ）的神經(jīng)毒性作用受到諸多研究者的關(guān)注［1－3］。神經(jīng)鞘脂代謝物包括神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1－磷酸鞘氨醇（sphingosine 1＿phospate，S1p）等多種代謝產(chǎn)物，目前證明這些代謝產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。Cer和Sph是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，能夠抑制細(xì)胞生長促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物S1p則刺激細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡［4］。有人將Cer、Sph和S1p稱為“鞘磷脂變阻器”，SPK是“鞘磷脂變阻器”的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SPK將Sph轉(zhuǎn)化為S1p。國外研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25－35誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞凋亡過程中SPK1活性減低，提示其活性下降參與AD的發(fā)病機(jī)制，體外高表達(dá)SPK1能否減輕Aβ對(duì)神經(jīng)元的損傷值得進(jìn)一步研究。腺病毒表達(dá)載體是目前重要的轉(zhuǎn)基因病毒載體，可以高效介導(dǎo)基因體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。鑒此，我們成功構(gòu)建了Ad－CMV－SPK1，本文主要研究Ad－CMV－EGFP對(duì)N2a細(xì)胞感染的量效與時(shí)程變化，以及Ad－CMV－SPK1在N2a細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究SPK1的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料攜帶人SPK野生型基因pcDNA3＊SPKWT（FLAG）質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所段海峰老師惠贈(zèng)；N2a細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；高糖DMEM培養(yǎng)基和OPTI－MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清均購自GIBCO公司；Ad－CMV－EGFP和Ad－CMV－SPK1由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司協(xié)助構(gòu)建完成，激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV500，日本）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒對(duì)N2a細(xì)胞的感染效率研究

1.2.1.1 不同感染滴度的重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞72h后感染效率。

在96孔板中接種5×103個(gè)／孔N2a細(xì)胞，待細(xì)胞融合率為60%－70%時(shí)，分別加入 MOI為0、2.5、5、10、25、50、100的 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細(xì)胞。72h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，并以流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光陽性細(xì)胞百分率作為感染效率的判定指標(biāo)，以確定適宜的MOI。

1.2.1.2 重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細(xì)胞感染效率時(shí)程變化 以MOI為25的Ad－CMVEGFP感染N2a細(xì)胞后不同時(shí)間（24h、48h、72h和96h）收集細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其感染效率。

1.2.2 重組腺病毒介導(dǎo)的人SPK1基因在N2a細(xì)胞中的表達(dá)

細(xì)胞分為三組：第1組為對(duì)照組（未感染病毒組），第2組為感染空病毒組，第3組為感染Ad－CMV－SPK1組。在6孔板接種N2a細(xì)胞感染72h后收集各組細(xì)胞，用裂解液處理提取蛋白，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒對(duì)N2a細(xì)胞的感染效率的研究

2.1.1 不同感染滴度的重組腺病毒 Ad－CMVEGFP感染N2a細(xì)胞72h感染效率

用不同感染滴度的腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞后72h收集細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)了其感染效率，并在共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。重組腺病毒載體對(duì)N2a細(xì)胞的感染效率在一定范圍內(nèi)隨著MOI的增加而增高（表1）；MOI為100時(shí)共聚焦熒光顯微鏡下幾乎100%的細(xì)胞均呈綠色（圖1），流式細(xì)胞儀測(cè)其感染率高達(dá)99.7%（圖2）。MOI為25時(shí)感染效率為99.3%（圖3），我們選用MOI＝25為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的感染滴度。

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞72小時(shí)感染效率（±s）

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞72小時(shí)感染效率（±s）

注：n＝3，＊＊與前一組比較P＜0.001，＊＊＊與前一組比較P＜0.0001

MOI（pfu／cell） 細(xì)胞綠色熒光蛋白陽性百分率1.0 55.70±0.776 2.5 70.00±3.758＊＊＊5.0 83.90±1.229＊＊＊10.0 94.50±0.954＊＊25.0 98.03±0.721 50.0 99.33±0.175 100.0 99.57±0.133

圖1 重組腺病毒（MOI＝100）感染N2a細(xì)胞72h共聚焦顯微鏡觀察

圖2 重組腺病毒（MOI＝100）感染N2a細(xì)胞72h流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染率

2.1.2 重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細(xì)胞感染效率時(shí)程變化 以MOI＝25的Ad－CMVEGFP感染N2a細(xì)胞后，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)其感染效率（表2）。以MOI＝25的滴度感染N2a細(xì)胞24小時(shí)感染率為（22.30±0.186）%，48小時(shí)感染率為（76.63±1.041）%，72小時(shí)達(dá)到峰值，96小時(shí)有所下降（P＜0.05）。

圖3 重組腺病毒（MOI＝25）感染N2a細(xì)胞72h流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染率

表2 重組腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞感染效率的時(shí)程變化（±s）

表2 重組腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞感染效率的時(shí)程變化（±s）

注：n＝3，＊代表與前一組比較P＜0.05，＊＊＊代表與前一組比較P＜0.0001

時(shí)間（h） 感染效率24 22.30±0.186 48 76.63±1.041＊＊＊72 98.03±0.722＊＊＊96 94.80±0.231＊

2.2 重組腺病毒感染N2a細(xì)胞，SPK1蛋白 Western blot鑒定

重組腺病毒感染N2a細(xì)胞72h進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果如圖4所示，感染 Ad－CMV－SPK1組與對(duì)照組和空病毒組相比，蛋白表達(dá)量顯著增高，因其在約72KD處有融合蛋白（SPK1－EGFP）的表達(dá)。

圖4 重組腺病毒感染N2a細(xì)胞72h后，SPK1蛋白Western blot檢測(cè)

3 討論

SPK是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的一個(gè)重要代謝酶，目前SPK家族共有8個(gè)同工酶被克隆和鑒定，其中SPK1和SPK2源自人類和小鼠［5］。SPK1主要分布在腦、肺、心臟、脾臟和肝臟。SPK2比SPK1多200個(gè)氨基酸，主要分布在肝臟和心臟［6］。SPK1的催化產(chǎn)物S1p是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的同時(shí)具有細(xì)胞內(nèi)第二信使和細(xì)胞外第一信使雙重功能的脂類生物活性分子［7］。SPK1／S1p在抗細(xì)胞凋亡中具有最要地位，其在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如AD的地位受到眾多研究者的關(guān)注，Gomez［8］2007年發(fā)現(xiàn)在 Aβ25－35誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞凋亡過程中SPK1活性減低的結(jié)果，推測(cè)SPK1活性的下降可能參與AD發(fā)病機(jī)制，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SPK1質(zhì)粒可以減輕細(xì)胞損傷，提示調(diào)節(jié)其活性將有助于AD的治療。

腺病毒載體因具高感染效率等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療領(lǐng)域中最有應(yīng)用前途的載體系統(tǒng)。本研究通過感染效率實(shí)驗(yàn)確定了適宜的MOI，重組腺病毒載體Ad－CMV－EGFP感染N2a細(xì)胞72小時(shí)，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果表明 MOI＝100時(shí)，感染效率高達(dá)（99.57±0.133）%，MOI＝25時(shí)感染效率為（98.03±0.721）%，我們選擇 MOI＝25感染N2a細(xì)胞，72小時(shí)內(nèi)感染效率隨時(shí)間升高，72小時(shí)達(dá)到峰值，96小時(shí)略有下降（P＜0.05）。我們將Ad－CMV－SPK1感染N2a細(xì)胞，通過western blot檢測(cè)SPK1在N2a細(xì)胞有效表達(dá)。本研究結(jié)果表明：①重組腺病毒載體對(duì)N2a細(xì)胞具有很高的感染效率。②重組腺病毒載體感染N2a細(xì)胞在72－96小時(shí)內(nèi)感染效率較高。③腺病毒載體具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)基因功能。

本研究確定了攜帶人SPK1基因的重組腺病毒基因在N2a細(xì)胞中具較高的感染效率及基因表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究SPK1與阿爾茨海默病之間的關(guān)系提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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