胡北俠，王 艷，楊少華，許傳田，黃艷艷，張秀美

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250100；2.六和飼料股份有限公司動保中心，山東 青島266109）

新城疫是嚴(yán)重危害我國和世界養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒性傳染病之一，病原是新城疫病毒（NDV）。NDV屬于單股負(fù)鏈、不分節(jié)段RNA病毒，基因組長度約為15.2kb，包括3′－NP－P－M－F－HN－L－5′六個(gè)基因，分別編碼6種主要結(jié)構(gòu)蛋白［1］。NDV只有一個(gè)血清型，但是可以分為不同的基因型。最近研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)病毒基因組長度、F基因和L基因序列，NDV可分為兩大分支：ClassⅠ和ClassⅡ［2］。ClassⅠNDV主要包括水禽和活禽市場分離株，而ClassⅡNDV可以分為基因Ⅰ～Ⅸ型，包括家禽、寵物鳥以及野鳥分離株［3－4］，研究表明，基因Ⅶ是我國目前NDV流行株的優(yōu)勢基因型。

流行病學(xué)研究證明，水禽是NDV的天然貯存宿主［3］。自1997年以來，國內(nèi)不斷有水禽感染NDV發(fā)病的報(bào)道［5］，似乎表明NDV的流行病學(xué)已經(jīng)發(fā)生新的變化。自2008年11月至2009年2月，本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生產(chǎn)蛋下降的兩個(gè)肉種鴨群中分離了兩株NDV強(qiáng)毒，并對其F基因和HN基因進(jìn)行了序列分析和同源性比較，進(jìn)一步豐富了NDV的分子流行病學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 SPF雞、雞胚、菌種、質(zhì)粒和試劑 SPF雞、雞胚由山東家禽所SPF雞研究中心提供。工程菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNA抽提試劑、DNA回收、PCR試劑盒等，均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒分離鑒定 取病鴨氣管、肝臟和輸卵管等組織研磨、無菌處理后接種10～11日齡SPF胚。用ND，禽流感（H5、H9）陽性血清和NDV單抗對分離毒進(jìn)行鑒定。參考文獻(xiàn)［1］方法進(jìn)行雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）和1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）的測定。

1.3 引物、病毒RNA提取及RT－PCR 擴(kuò)增F和HN基因的引物序列參考文獻(xiàn)［6］。

病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR均采用50μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.4 目的基因的克隆與序列測定 將各PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳回收各目的條帶進(jìn)行抽提、純化后與pMD18－T vector進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和藍(lán)／白斑篩選，挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，送北京華大基因研究中心測序。

1.5 F基因（374bp）分型與同源性比較 參考文獻(xiàn)［3－5］等基因分型方法，利用DNAStar 7.0（MegAlign）軟件對NDV分離株和參考株進(jìn)行F基因分型，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。分別對鴨NDV分離株和參考毒株的F基因和HN基因全長同源性進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定 兩份鴨病料接種SPF雞胚后于48～84h致死雞胚，尿囊液HA效價(jià)為28和27，HI試驗(yàn)中與NDV陽性血清、NDV單抗反應(yīng)陽性，與AIV（H5、H9）陽性血清反應(yīng)均為陰性，初步確定為 NDV，分別命名為Duck／China／SD6／2008 和Duck／China／SD7／2009，其 MDT 分別為77.6h，ICPI為2.0，符合強(qiáng)毒NDV的特征。

2.2 病毒F、HN基因RT－PCR和序列測定結(jié)果F、HN基因均擴(kuò)增出了目的片段（圖略）。經(jīng)測序后，F(xiàn)基因開放閱讀框架（ORF）全長1 662bp，編碼553個(gè)氨基酸，第112～117位氨基酸序列為112－RRQKRF－117，符合強(qiáng)毒NDV F蛋白裂解位點(diǎn)的分子特征。HN基因ORF全長1716bp，編碼571個(gè)氨基酸。

2.3 F基因（1－374bp）基因分型與同源性比較從圖1可以看出，2個(gè)鴨NDV分離株屬于NDV ClassⅡ分支，與國內(nèi)近年來分離的基因ⅦNDV遺傳距離較近，而與健康鴨群NDV分離株Duck／China／58／2008［7］遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖1 根據(jù)NDV F基因高變區(qū)（374bp）繪制的遺傳進(jìn)化樹

F和HN基因全長同源性分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)鴨NDV分離株與與基因ⅦNDV分離株同源性較高，分別為94.1%～99.7%和94.4%～97.1%，與同期分離的雞源NDV強(qiáng)毒株Chicken／China／SD4／2008（HM748947）同源性最高，分別為99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，而與健康鴨群 NDV分離株Duck／China／58／2008（ClassⅠ分支）同源性為65.1%～65.3%和72.3%～72.6%。兩個(gè)鴨分離株 Duck／China／SD6／2008和 Duck／China／SD7／2009F基因和HN基因全長同源性分別為99.8%和99.5%。

3 分析與討論

隨著臨床上鴨群感染NDV發(fā)病的不斷出現(xiàn)，山東省部分蛋鴨或種鴨群已進(jìn)行ND疫苗的免疫，本研究的發(fā)病鴨群也已進(jìn)行ND免疫，發(fā)生產(chǎn)蛋下降前NDHI抗體滴度分別為6.3log2～7.4log2和9.4log2～12log2，鴨群主要表現(xiàn)采食量下降，死淘率正常，產(chǎn)蛋下降15%～30%，畸形蛋增加。從發(fā)生產(chǎn)蛋下降到恢復(fù)正常一般需要2～4周，新城疫HI抗體滴度并沒有明顯的升高（另文報(bào)道），而雞群感染NDV發(fā)生產(chǎn)蛋下降前后HI抗體滴度一般會升高2log2左右，具體原因尚有待進(jìn)一步研究。

建立在NDV F基因高變區(qū)（374bp）的系統(tǒng)進(jìn)化和基因分型方法已被證明是NDV分類的最有效方法，廣泛用于NDV的分子流行病學(xué)研究?；蚍中徒Y(jié)果表明，2個(gè)鴨NDV分離株屬于基因Ⅶ，與國內(nèi)近年來分離的基因ⅦNDV遺傳距離很近，特別是與本實(shí)驗(yàn)室同期分離的山東省雞源NDV強(qiáng)毒株（Chicken／China／SD4／2008）遺傳距離最近，而與本實(shí)驗(yàn)室從健康鴨群分離的ClassⅠ NDV（Duck／China／58／2008）明顯不同。F基因和HN基因全長序列分析結(jié)果表明，2個(gè)鴨NDV分離株與同期雞源NDV 分離株 Chicken／China／SD4／2008 核苷酸同源性分別為99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，與健康鴨群NDV分離株Duck／China／58／2008同源性為65.1%～65.3%和72.3%～72.6%，表明2個(gè)鴨NDV分離株可能來源于雞群，而與從健康鴨群分離的NDV弱毒株無關(guān)。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：743－748.

［2］Alíz Czeglédi，Dorina Ujvári，Eszter Somogyi，etal.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1（Newcastle disease virus）and evolutionary implications［J］.Virus Research，2006，120：36－48.

［3］L Mia Kim，Daniel J King，Phillip E Curry，etal.Phylogenetic Diversity among Low－Virulence Newcastle Disease Viruses from Waterfowl and Shorebirds and Comprarion of Genotype Distributions to Those of Poultry－Origin Isolates［J］.Journal of Virology，2007，12：12641－12653.

［4］L Mia Kim，Daniel J King，David L Suarez，etal.Characterization of ClassⅠNewcastle Disease Virus Isolates from Hong Kong Live Bird Markets and Detection Using Real－Time Reverse Transcription－PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，4：1310－1314.

［5］劉秀梵.家養(yǎng)水禽A型流感和新城疫病毒的感染和臨床疾?。跜］.第15屆世界禽病大會（中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會）論文集，2007：87－95.

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