魏述永，吳俊偉，陳紅偉，李 賽，劉俊瑋

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

動(dòng)物源大腸桿菌喹諾酮類藥物（Qs）耐藥性控制研究具有巨大的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義，目前國內(nèi)外研究主要集中在新藥開發(fā)、外排泵抑制劑等方面［1－3］，但新藥開發(fā)并不是控制耐藥性的有效手段，外排泵抑制劑研究距離實(shí)際應(yīng)用也有很大的距離。本文在前期研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度黏菌素可以增加FQs對耐藥大腸桿菌抗菌作用的基礎(chǔ)上［4］，以亞抑菌濃度黏菌素處理大腸桿菌，探討其對外膜蛋白表達(dá)量及OF攝入量的影響，從而為大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥性控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購自美國菌種保存中心；FQs耐藥株29－2，西南大學(xué)榮昌校區(qū)藥學(xué)教研室分離保存。硫酸黏菌素，含量98%，批號：0809051；氧氟沙星，含量99.4%，批號：200806023；均由重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供。蛋白提取相關(guān)試劑，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Waters2695高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，美國Waters公司。

1.2 色譜條件［5］Diamonsil C18柱（250nm×4.6 nm，5μm）；流動(dòng)相：0.05mol／L枸櫞酸－乙腈（79∶21），用乙醇胺調(diào)節(jié)pH 值至4.0；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：20μL；激發(fā)波長：295nm；發(fā)射波長：505nm；柱溫：40℃；Waters2475熒光檢測器。

1.3 黏菌素亞抑菌濃度的測定及細(xì)菌培養(yǎng) 采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（clinical and laboratory standards instituet，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定黏菌素對受試菌的MIC，并以含1／2MIC黏菌素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)菌過夜。

1.4 外膜蛋白提取、含量測定及SDS－PAGE 參照 Kalle B（1989）的方法并改進(jìn)［6］。LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至 OD600＝1A，30mmol／L Tris Cl（pH 值7.5）洗滌濕菌1次，精密稱取3.000 0g濕菌，40mL溶液（含冷30mmol／L Tris HCl、1mmol／L MgCl2、0.1 mg／mL DnaseⅠ、RnaseB，pH 值7.5）重懸，冰浴、超聲破碎，2 000r／min離心10min，去除未破碎細(xì)胞，取上清加入終濃度2%十二烷基肌酸鈉，20℃培養(yǎng)20min去除內(nèi)膜及非膜蛋白，100 000g冷凍離心1h去上清，蒸餾水溫和洗滌沉淀，1.1mL溶液（1%SDS、0.5mol／L NaCl、30mmol／L Tris HCl、10mmol／L EDTA，pH值7.5）溶解沉淀中的膜蛋白，超聲裂解2min，37℃培養(yǎng)30min，100 000r／min冷凍離心15min，上清為膜蛋白。分別于260 nm、280nm處測定蛋白樣品的吸光度，按照公式“蛋白濃度（mg／mL）＝1.450A280－0.740A260”計(jì)算蛋白含量［7］。對蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE檢測，積層膠為5%，分離膠為8%，點(diǎn)樣量均為10μL／孔。電泳完畢后以考馬斯亮藍(lán)R250對凝膠染色，過夜，用脫色液（含30%甲醇，10%冰醋酸）脫色至蛋白條帶清晰為止。

1.5 細(xì)菌對OF的攝入動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將 OF用0.1mol／L鹽酸甘氨酸（pH 值3.0）配成濃度為1×10－5、5×10－5、2×10－4、1×10－3、2×10－3、1×10－2、2×10－2mg／L和1×10－1mg／L，采用高效液相色譜熒光檢測法測定相應(yīng)峰面積后，繪制峰面積與OF含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 菌體內(nèi) OF 攝入量的測定［8］將29－2和ATCC25922分別接種于20mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至指數(shù)生長中期（OD650＝0.7～0.8），4 000r／min（4℃）離心10min，收集菌體稱重，用50 mmol／L PBS（pH 值7.0）沖洗2次，PBS重懸細(xì)菌（使細(xì)菌濃度為40mg／mL），37℃溫浴10min；加Colisitin（0.25、0.125μg／mL）、OF（10μg／mL）于菌液中，分別在加入 OF后的10、30、60、120、180、300、600、900、1 500s時(shí)取樣（每管取0.25mL）；取樣后，立即加1.25mL預(yù)冷的PBS（同上），8 000r／min（4℃）離心5min，沉淀用緩沖液洗1次，同樣條件離心，棄上清，沉淀物加鹽酸甘氨酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 值3.0）1mL，26℃水浴2h；離心沉淀，取上清液用高效液相進(jìn)行熒光檢測。

1.6 處理前后受試菌對OF的MIC 采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定Sub－Colistin處理前后受試菌對OF的MIC，比較處理前后藥物敏感性變化。

2 結(jié)果

2.1 Sub－Colistin對受試菌OF MIC的影響 加入Sub－Colisitin后，質(zhì)控菌、耐藥菌對OF的敏感性升高1倍，見表1。

表1 受試菌的 MIC值（μg／mL）

2.2 外膜蛋白含量測定 見表2。

表2 外膜蛋白含量

2.3 SDS－PAGE結(jié)果 見圖1。

圖1 SDS－PAGE電泳結(jié)果

2.4 受試菌OF攝入量結(jié)果 見表3和圖2。

表3 受試菌OF攝入量

圖2 OF菌體攝入量結(jié)果

3 討論

喹諾酮類藥物必須進(jìn)入菌體內(nèi)部才能發(fā)揮作用，大腸桿菌外膜上與Qs轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的有兩個(gè)通道，分別稱為OmpF和OmpC，當(dāng)OMP表達(dá)量降低影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，細(xì)菌即可發(fā)生耐藥［7－8］，但 Hirai K 對大腸埃希氏菌norC突變株的研究表明，僅由膜通透性降低所引起的藥物蓄積濃度減少極其有限［9］。

本研究結(jié)果顯示，ATCC25922與OF耐藥菌29－2外膜蛋白有明顯差異，29－2外膜蛋白表達(dá)量低（試驗(yàn)條件下為0.0397mg／mL），電泳檢測沒有蛋白條帶顯示，說明29－2存在外膜蛋白表達(dá)降低的耐藥機(jī)制。Sub－Colistin處理后，29－2OMP表達(dá)量明顯增多，達(dá)到 25.52mg／mL，與黏菌素處理后ATCC25922的表達(dá)量相當(dāng)（20.45mg／mL），說明黏菌素可使29－2外膜蛋白表達(dá)量顯著增加，但具體原因尚無相關(guān)報(bào)道，有待深入研究。質(zhì)控菌黏菌素處理后，OMP量有所下降，可能與黏菌素本身抑菌作用有關(guān)。結(jié)合OF菌體攝入量分析，29－2的攝入量（1.21～2.79ng／mL）明顯低于ATCC25922（4.51～6.83ng／mL），與其對 OF的敏感性相符，Sub－Colistin處理后，2株細(xì)菌OF的攝入量均增加1ng／mL左右（見2.4），說明Sub－Colistin處理對于質(zhì)控菌及耐藥菌OF攝入量的影響差異不大，這也是2株細(xì)菌Sub－Colistin處理后OF的敏感性僅升高1倍（見2.1）的原因。上述結(jié)果表明，Sub－Colistin處理后，耐藥菌OMP表達(dá)量升高，但對大腸桿菌OF攝入量及敏感性的恢復(fù)作用有限，與Hirai K［9］報(bào)道相符。說明OMP表達(dá)量降低不是導(dǎo)致臨床分離多重耐藥大腸桿菌29－2對OF耐藥的決定原因。

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［3］張志平.喹諾酮類抗菌藥研究的新進(jìn)展［C］／／第四屆全國喹諾酮類抗菌藥科研與臨床應(yīng)用研討會(huì)論文（摘要）匯編.成都：中國抗生素雜志社，2000：1－20.

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