劉 瀾，張俊儒，張 強(qiáng)，莫 云，杜繼紅，張 雁，文 波，5，楊秀玉

(1.北京大北農(nóng)動(dòng)物保健技術(shù)研究中心，北京 101407;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730050;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107;4.北京市朝陽(yáng)區(qū)種植業(yè)養(yǎng)殖業(yè)服務(wù)中心，北京 100018;5.韶山大北農(nóng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，湖南韶山 411300;6.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄類(lèi)動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，也是人畜共患的傳染病?？梢鹩仔笏劳?、產(chǎn)奶量下降、肉品質(zhì)下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，全世界每年由此造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)百億美元[1]。國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)將其列為A類(lèi)動(dòng)物疫病的第一位，我國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病之首。在自然狀態(tài)下FMDV可經(jīng)消化道感染，經(jīng)呼吸道感染是最主要的傳播途徑，動(dòng)物、人員及運(yùn)輸工具等均可機(jī)械性地散播病毒[2]。一旦發(fā)現(xiàn)疫情，徹底、科學(xué)的消毒是控制疫情傳播的最好方法。復(fù)方煤焦油酸溶液主要成分為高沸點(diǎn)煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等，具有高效、超強(qiáng)廣譜、超級(jí)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前已在世界范圍內(nèi)廣泛用于口蹄疫、禽流感等烈性傳染病的控制。本文通過(guò)試驗(yàn)考察復(fù)方煤焦油酸溶液對(duì)口蹄疫病毒的殺滅效果，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 消毒劑:韶山大北農(nóng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液，批號(hào)11030701;對(duì)照藥物，國(guó)外某公司生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液，批號(hào)1011LA0043;O型口蹄疫病毒ELISA檢測(cè)試劑盒，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:4日齡吮乳乳鼠(清潔級(jí)昆明小鼠)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供。

病毒的制備和稀釋:O型口蹄疫乳鼠組織毒(LD50=1×10-8.0，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供)，用0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成1∶500倍病毒懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 安全性試驗(yàn) 安全性試驗(yàn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將復(fù)方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶100、1∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500、1 ∶600 倍稀釋?zhuān)缓蠓纸M皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠注射0.2 mL復(fù)方煤焦油酸溶液稀釋液，每組注射5只，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組乳鼠每只注射0.2 mL去離子水。每組設(shè)置4個(gè)平行。注射后連續(xù)觀察72 h，記錄乳鼠發(fā)病死亡情況。另以對(duì)照藥物替代復(fù)方煤焦油酸溶液，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn) 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。根據(jù)安全性試驗(yàn)結(jié)果，將復(fù)方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀釋?zhuān)缓笠来闻c1 ∶500倍稀釋的 O型口蹄疫乳鼠組織毒等量混合，室溫作用30 min后皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠背部皮下注射0.2 mL消毒劑-病毒混合液，每組注射5只;同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組，每組4只乳鼠，每只乳鼠皮下注射0.2 mL 1∶1000倍稀釋的病毒液;設(shè)健康對(duì)照組，健康對(duì)照每組2只，每只乳鼠皮下注射0.2 mL去離子水。每組設(shè)置5個(gè)平行。注射后連續(xù)觀察7 d，記錄情況。另以對(duì)照藥物替代復(fù)方煤焦油酸溶液，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 病毒抗原檢測(cè) 將各組發(fā)病死亡乳鼠的胴體加0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)研磨后制成1∶10(W/V)懸液，健康對(duì)照組在觀察7 d后處死，同樣將胴體研磨后制成1∶10(W/V)懸液，懸液放置4℃過(guò)夜，6000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。ELISA檢測(cè)方法:用包被緩沖液稀釋FMDV O型兔血清至工作濃度(1∶200)，加入包被酶標(biāo)板，置于4℃過(guò)夜;用PBS洗滌后加入試劑盒陽(yáng)性對(duì)照和上述樣品，置于37℃旋轉(zhuǎn)振蕩器中振蕩50 min;再用PBS洗滌后加入1∶100稀釋的FMDV O型豚鼠抗血清，封板后置于37℃旋轉(zhuǎn)振蕩器中振蕩40 min;酶標(biāo)板洗滌后加1∶400稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃振蕩孵育40 min;洗滌后加入鄰苯二胺(OPD)溶液(含H2O2)，37℃避光振蕩孵育15 min，加1.25 mol/L硫酸終止液，混勻后在492 nm下讀取OD值。

1.3 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 消毒劑安全性判定標(biāo)準(zhǔn):乳鼠不死亡，判為安全，反之為不安全。消毒劑殺滅病毒效果判定標(biāo)準(zhǔn):1)病毒對(duì)照組乳鼠在接種病毒后發(fā)病死亡，并從乳鼠體內(nèi)檢測(cè)到口蹄疫病毒增殖，且健康對(duì)照組試驗(yàn)期間無(wú)異常表現(xiàn)，全部健康活潑，視為試驗(yàn)成立;2)消毒劑試驗(yàn)組乳鼠在試驗(yàn)期間無(wú)異常表現(xiàn)，全部健康活潑，判定消毒劑該濃度下產(chǎn)品有效;3)消毒劑試驗(yàn)組有乳鼠死亡，并從乳鼠體內(nèi)檢測(cè)到口蹄疫病毒增殖，判定消毒劑該濃度下產(chǎn)品無(wú)效。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性試驗(yàn)結(jié)果 消毒劑對(duì)乳鼠的安全性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物在1∶100～1∶400倍稀釋下接種乳鼠均有死亡，在1∶500和1∶600倍稀釋下均未見(jiàn)接種乳鼠死亡，陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)接種乳鼠死亡。表明1∶500倍以上稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物皮下注射乳鼠不會(huì)產(chǎn)生致死反應(yīng)，乳鼠安全。安全性試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示。

表1 復(fù)方煤焦油酸溶液對(duì)動(dòng)物的安全性測(cè)定結(jié)果

表2 對(duì)照藥物安全性測(cè)定結(jié)果

2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)安全性試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)的消毒劑濃度設(shè)置為1 ∶500、1 ∶600、1 ∶700、1 ∶800 倍稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和健康對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物在1∶500和1∶600倍稀釋下，接種乳鼠均未死亡，全部健康活潑;而在1∶700和1∶800倍稀釋下，接種乳鼠均有死亡，且1∶800倍稀釋較1∶700倍稀釋死亡乳鼠顯著增加。表明1∶500和1∶600倍稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物可能滅活了O型口蹄疫乳鼠組織毒，而1∶700和1∶800倍稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物可能沒(méi)有有效滅活O型口蹄疫乳鼠組織毒，導(dǎo)致部分乳鼠感染FMD而死亡。復(fù)方煤焦油酸溶液和對(duì)照藥物對(duì)口蹄疫病毒的殺滅效果試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。

表3 復(fù)方煤焦油酸溶液殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果

表4 對(duì)照藥物殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病毒ELISA檢測(cè)結(jié)果 在對(duì)FMD病毒ELISA檢測(cè)中，攻毒用1∶500倍稀釋的O型口蹄疫乳鼠組織毒OD值為0.306;健康對(duì)照組樣品的平均OD值為0.008，表明健康對(duì)照組乳鼠未感染FMD病毒;陽(yáng)性對(duì)照組的平均OD值為1.600，表明陽(yáng)性對(duì)照組乳鼠均感染FMD病毒，且病毒在乳鼠體內(nèi)大量增殖。實(shí)驗(yàn)各組中死亡乳鼠樣品的OD值詳見(jiàn)表5，經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，復(fù)方煤焦油酸溶液1∶700、1 ∶800 及對(duì)照藥物 1 ∶700、1 ∶800 的OD值與1∶500倍稀釋的乳鼠組織毒OD值差異極顯著(P＜0.01)，表明實(shí)驗(yàn)中各死亡乳鼠被FMD病毒感染，且病毒在乳鼠體內(nèi)大量增殖。

表5 FMD病毒ELISA檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

口蹄疫病毒屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是一種無(wú)囊膜的病毒。國(guó)內(nèi)外對(duì)其抵抗力的研究中，一般認(rèn)為FMDV對(duì)環(huán)境中的不利因素有較強(qiáng)的抵抗力，在4℃比較穩(wěn)定，低溫條件下可長(zhǎng)期存活，對(duì)熱和干燥有一定的抵抗力，對(duì)酚類(lèi)、醇類(lèi)等消毒劑不敏感[4]。但FMDV對(duì)酸很敏感，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值能達(dá)到滅活口蹄疫病毒的效果，在pH 6.5的緩沖溶液中，在4℃條件下14 h內(nèi)，可滅活 90%;pH 5.5時(shí)，1 min滅活90%[5]。控制口蹄疫疫情的傳統(tǒng)的消毒方法有10～20 g/L的氫氧化鈉、10 mL/L的甲醛溶液、50～500 g/L的碳酸鹽等浸泡或噴灑污染物，但這些消毒劑的腐蝕性和刺激性強(qiáng)[6-8]。

復(fù)方煤焦油酸溶液由高沸點(diǎn)煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等復(fù)方配制而成，具有低pH值(pH值在2.0～2.4之間)、超強(qiáng)的表面粘著和滲透性及生物安全等優(yōu)點(diǎn)，目前已被世界各地廣泛選擇用于流行病的防控。在法國(guó)、英國(guó)、美國(guó)被政府指定為口蹄疫專(zhuān)用消毒劑，在韓國(guó)也被用于口蹄疫的控制，在泰國(guó)被用于禽流感的控制等。我國(guó)1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定復(fù)方煤焦油酸溶液用于畜禽舍及器具的消毒。由Antec International-A Dupont Company生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液(FarmFliud S)自20世紀(jì)進(jìn)口到我國(guó)以來(lái)，被規(guī)模豬場(chǎng)推崇應(yīng)用于動(dòng)物欄舍及環(huán)境的消毒和口蹄疫疫情的防控。國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)眾多的類(lèi)似產(chǎn)品，但因其在工藝技術(shù)等方面千差萬(wàn)別，導(dǎo)致產(chǎn)品在消毒效力、安全性等方面也存在較大的差異。北京大北農(nóng)動(dòng)物保健技術(shù)研究中心和韶山大北農(nóng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司通過(guò)對(duì)復(fù)方煤焦油酸溶液配方及工藝技術(shù)等多方面的深入研究，攻克了復(fù)方煤焦油酸消毒劑制備技術(shù)難點(diǎn)，極大地提高了復(fù)方煤焦油酸消毒劑在消毒效力、安全性等方面特性。

上述試驗(yàn)表明，此煤焦油酸消毒劑1∶600倍稀釋液在室溫條件下與O型口蹄疫乳鼠組織毒作用30 min，能100%殺滅口蹄疫病毒，可用于口蹄疫病毒污染的動(dòng)物欄舍、運(yùn)載工具及環(huán)境等消毒，其消毒效力、安全性等方面與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品(對(duì)照藥物)相當(dāng)。

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