齊海濤，閆軍霞，粟 碩，黃 震，曹 楠，譚力凱，孔維立，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

豬流感（SI）是由A型流感病毒引起的豬的一種急性、傳染性呼吸道疾病，以發(fā)熱、流鼻液、咳嗽、食欲減退等癥狀為特征，病豬可在短期內(nèi)康復(fù)，但會降低飼料報酬，延遲上市時間。目前豬群中的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3種亞型。我國豬群中普遍存在H3和H1亞型感染。更為重要的是，豬可以被禽流感病毒和人流感病毒同時感染，豬被認為是流感病毒的“混合器”，在“禽－豬－人”的傳播鏈中具有獨特的地位［1－2］，SI具有重要的公共衛(wèi)生意義。

2009年在墨西哥、美國等國家相繼暴發(fā)甲型H1N1流感，疫情很快在全球范圍內(nèi)傳播，并導致人死亡［3］。2011年12月美國 H3N2流感感染人事件，并在人與人之間傳播，引起人們的廣泛關(guān)注。本論文對分離到的1株SIV進行全基因序列測定及序列分析，從分子水平闡明廣東地區(qū)的豬流感流行狀況和遺傳演化情況，為進一步闡述豬在流感病毒分子流行病學以及“禽－豬－人”跨種間傳播奠定基礎(chǔ)，為流感的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準陽性血清 H1、H3、H5、H9亞型標準陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學禽病研究室保存。

1.1.2 SPF雞胚 購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，置生化培養(yǎng)箱中37℃孵育至9～11日齡。

1.1.3 主要儀器 高速低溫冷凍離心機、T gradient PCR儀、L8－M冷凍離心機等。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集、病毒分離及純化 2010～2011年從廣東豬場采集60份流感癥狀豬鼻拭子和病豬肺組織。常規(guī)方法尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，37℃孵育，72h收集尿囊液，測定血凝效價（HA），將陽性的病毒分離物用SPF雞胚進行3輪有限稀釋克隆純化。

1.2.2 病毒亞型的鑒定 將純化的病毒株通過豬流感病毒 H1、H3、N1、N2亞型分型RT－PCR方法［4］和序列測定，進行HA和NA亞型鑒定。

1.2.3 病毒全基因序列的測定及遺傳演化分析根據(jù)GenBank中登錄的豬流感病毒序列，設(shè)計流感病毒通用引物8對。對H3N2亞型流感分離株的全基因組進行克隆、序列測定，用Lasergene7.0軟件包進行序列拼接和分析，用MEGA4.0分析軟件制作基因進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞型鑒定結(jié)果 從60份樣品中分離到SIV 1株，通過豬流感病毒H1、H3、N1、N2亞型分型RTPCR方法對該株SIV進行了HA和NA亞型的鑒定，該毒株為H3N2亞型豬流感病毒。測序結(jié)果與SIV分型RT－PCR方法的鑒定結(jié)果一致。命名為A／swine／Guangdong／L22／10（H3N2）。

2.2 RT－PCR擴增結(jié)果 以流感病毒總RNA為模板，分別用設(shè)計好的8對通用引物對PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8個基因片段進行 RTPCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，擴增的各片段大小與預(yù)期目的片段相符。

2.3 核苷酸同源性 將H3N2亞型流感病毒的全基因序列提交至NCBI BLAST SERVER進行聯(lián)機檢索，用Lasergene7.0中的 MegAlign程序中的ClustalW對其核苷酸序列進行相似性比較分析。結(jié)果表明，本研究毒株的8個基因片段與廣東地區(qū)2005年和2006年豬群中流行的豬流感病毒（4個毒株均為人源SIV）基因的相似性，在99.8%～100%之間（表1），與1999年前后人流感病毒代表株A／Moscow／10／99（H3N2）的 NA、M、NS、PB2、PB1基因片段相似性均為99.6%，HA、NP、PA的相似性均為99.5%。從BLAST結(jié)果可以看出，本試驗毒株近年來在豬群中比較穩(wěn)定，未和不同亞型、不同宿主和不同地域來源的流感病毒發(fā)生基因重組。

表1 流感毒株8個基因片段核苷酸序列Blast檢索結(jié)果

2.4 序列分子特征分析 H3N2亞型豬流感病毒的HA基因編碼區(qū)長1 701bp，編碼566個氨基酸。本試驗毒株的裂解位點為PEKQTR／GIF，與高致病性禽流感病毒裂解位點相比較，具有典型的低致病性流感病毒特征。大多數(shù)H3N2流感病毒HA蛋白含有6個比較保守的潛在糖基化位點，分別位于 HA1的 N8，22，38，165，285位以及 HA2上的483位。HA蛋白潛在糖基化位點的增加，可能會改變病毒的抗原性或是增強病毒的流行性，使其能夠逃避宿主的免疫壓力。例如，在人流感流行時，往往是HA中潛在糖基化位點較多的毒株能夠流行到最后［5］。不僅如此，潛在的糖基化位點的增加還能影響病毒的受體結(jié)合活性和抗原性，糖基化位點的數(shù)量和位置可能會影響蛋白質(zhì)的折疊、組裝、聚集和轉(zhuǎn)移［6］。本試驗豬流感病毒在63、122、126、133位和246位增加了5個潛在糖基化位點，在這些位點中，122，133和246位潛在糖基化位點為近代人源譜系毒株所特有。流感病毒的受體結(jié)合特異性與HA蛋白的受體結(jié)合位點密切相關(guān)。對人H3N2流感病毒而言，HA L226位（Leu）和S228位（Ser）氨基酸的改變影響病毒與SA－α－2，6－Gal的受體結(jié)合特性。通過受體結(jié)合位點的分析發(fā)現(xiàn)，本試驗毒株與宿主特異性有關(guān)的226～228位對應(yīng)的氨基酸為ISS具備人流感的分子特征，該病毒偏愛結(jié)合SA－α－2，6－Gal受體［7］，具備感染人的能力。

經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)流感病毒的NA蛋白有6個保守的潛在糖基化位點，分別位于61、86、146、200、234位和402位（表2），本試驗毒株與豬流感和人流感代表株相比在93、329位多了2個潛在的糖基化位點；NA蛋白的潛在糖基化位點的增加或減少可能會降低流感病毒與宿主受體的親和活力，也可能減少流感病毒顆粒的釋放［8］。本試驗SIV的N－端的Ser－31未發(fā)生突變［9］，說明沒有對金剛烷胺產(chǎn)生耐藥性。整個NS1編碼區(qū)中未發(fā)現(xiàn)缺失，92位也沒有出現(xiàn)抗干擾素的Glu［10］突變。PB2基因的627位氨基酸與宿主特異性和病毒復(fù)制能力密切相關(guān)，本試驗毒株的627位氨基酸位點為人源K，從氨基酸水平揭示該毒株具有感染哺乳動物的能力。

表2 NA基因潛在糖基化位點分析

2.5 病毒HA和NA基因核苷酸系統(tǒng)進化分析應(yīng)用MEGA4.0分析軟件，將該分離株的HA基因與GenBank上21株流感病毒的HA基因閱讀框架內(nèi)的核苷酸序列繪制系統(tǒng)進化樹，可以將豬和人的H3N2流感病毒大概分為最早期人流感譜系、早期人流感譜系、近代人流感譜系和經(jīng)典豬流感譜系4個 譜 系。 結(jié) 果 顯 示，A／swine／Guangdong／L22（H3N2）的8個基因片段處在近代人流感譜系內(nèi)，沒有和豬流感、禽流感病毒發(fā)生基因重組，與1999年前后人流感病毒株 A／Moscow／10／99（H3N2）親緣關(guān)系較近（圖1），與豬流感譜系親緣關(guān)系相對較遠。NA基因的進化分析也顯示相似的特征（圖2）。

3 結(jié)論與討論

本試驗毒株具有典型的低致病性流感病毒特征，從分子特征上看這個毒株可能來自人流感，具備感染人的能力。該病毒的NA蛋白頸部氨基酸無任何缺失，NS1蛋白的92位也沒有出現(xiàn)抗干擾素的Glu突變；M2蛋白對金剛烷胺也沒有產(chǎn)生耐藥性。結(jié)合目前中國豬場的用藥來看，豬群中沒有大規(guī)模的應(yīng)用干擾素、金剛烷胺等抗病毒藥物，因此該株流感病毒都沒有出現(xiàn)抗藥性突變。本毒株的8個片段全部處于近代人流感譜系內(nèi)，相似性分析結(jié)果也顯示，該毒株的8個基因片段與近代人流感病毒的相似性高，1998～2009年間從中國豬群中分離到的H3N2SIV大部分處于近代人流感譜系內(nèi)，與人流感病毒親緣關(guān)系較近，這一結(jié)果暗示著在不同時間內(nèi)均發(fā)生過人流感病毒傳染給豬的事件，這可能是與豬有密切接觸人員將人流感病毒傳染給豬，導致流感病毒在豬群中流行，但是這些病毒什么時候還會再感染人目前還不太清楚，需要不定期的監(jiān)測豬群中豬流感的流行狀況，為人流感的暴發(fā)預(yù)警。

豬在流感跨種間傳播過程中起著“混合器”和“中間宿主”的作用。最近美國CDC報道，由HA、NA等7個基因來源于人流感病毒，而M基因則來源于經(jīng)典H1N1豬流感病毒的重組H3N2流感病毒感染兩名美國兒童，給人類健康造成了潛在威脅，新奇重組流感病毒在豬群中不斷產(chǎn)生，也可能造成像PDM／09一樣產(chǎn)生新的一輪流感的暴發(fā)流行。本試驗分析發(fā)現(xiàn)，目前豬群中流行的H3N2流感毒株大部分為人流感，一旦在豬這個混合器中與豬流感病毒的基因片段發(fā)生重組，產(chǎn)生新奇流感病毒，病毒在豬體內(nèi)適應(yīng)之后再傳給人，那樣就可能給人類健康帶來嚴重的威脅。因此，在廣東地區(qū)開展豬流感的分子生物學和病毒遺傳進化規(guī)律的研究，對于及時掌握我國SIV流行株的變異情況，為豬群中流感病毒的監(jiān)測、分子生物學特征及其科學防控提供理論依據(jù)。

［1］Xerri L，Mathoulin M P，Birg F，etal.Heterogeneity of rearranged T－cell receptor V－alpha and V－beta transcripts in tumor－infiltrating lymphocytes from Hodgkin＇s disease and non－Hodgkin＇s lymphoma［J］.Am J Clin Pathol，1994，101（1）：76－80.

［2］Webster R G，Bean W J，Gorman O T，etal.Evolution and ecology of influenza A viruses［J］.Microbiol Rev，1992，56（1）：152－179.

［3］Dawood F S，Jain S，F(xiàn)inelli L，etal.Emergence of a novel swine－origin influenza A（H1N1）virus in humans［J］.N Engl J Med，2009，360（25）：2605－2615.

［4］齊海濤，孔維立，張桂紅.豬流感病毒 H1、H3、N1、N2亞型分型RT－PCR方法的建立［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012（3）：187－191.

［5］Seidel W，Kunkel F，Geisler B，etal.Intraepidemic variants of influenza virus H3hemagglutinin differing in the number of carbohydrate side chains［J］.Arch Virol，1991，120（3－4）：289－296.

［6］Igarashi M，Ito K，Kida H，etal.Genetically destined potentials for N－linked glycosylation of influenza virus hemagglutinin［J］.Virology，2008，376（2）：323－329.

［7］Rogers G N，Paulson J C，Daniels R S，etal.Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity［J］.Nature，1983，304（5921）：76－78.

［8］Matrosovich M，Zhou N，Kawaoka Y，etal.The surface glycoproteins of H5influenza viruses isolated from humans，chickens，and wild aquatic birds have distinguishable properties［J］.J Virol，1999，73（2）：1146－1155.

［9］Guo Y J，Krauss S，Senne D A，etal.Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2influenza virus lineages in Asia［J］.Virology，2000，267（2）：279－288.

［10］Seo S H，Hoffmann E，Webster R G.The NS1gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti－viral cytokine responses［J］.Virus Res，2004，103（1－2）：107－113.