代重山，李繼昌，馬 晶，高瑞霞

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

近10年來，由于世界范圍內(nèi)多重耐藥（MDR）革蘭陰性菌株的出現(xiàn)，特別是鮑曼不動(dòng)桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌的MDR的蔓延，已成為臨床治療的棘手問題，甚至引起暴發(fā)性播散感染，導(dǎo)致較高的死亡率，以及新抗生素的短缺，使得已被棄用20余年的黏桿菌素重新得以評(píng)估和使用［1］。Lim等［2］認(rèn)為，在未來5年，黏桿菌素將是臨床治療MDR革蘭陰性細(xì)菌感染的最佳選擇，也是最后的防線。

目前，黏桿菌素誘發(fā)的腎毒性與神經(jīng)毒性嚴(yán)重阻礙著臨床應(yīng)用，已經(jīng)引起臨床學(xué)者及科學(xué)家的廣泛關(guān)注，但其神經(jīng)毒性機(jī)制由中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)還是周圍神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)目前還不清楚［3］。動(dòng)物試驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，黏桿菌素可以引起動(dòng)物或人四肢麻木、四肢無力、下肢疼痛、感覺異常、多發(fā)性周圍神經(jīng)炎，這表明，黏桿菌素可能直接或間接的對(duì)周圍神經(jīng)造成損傷［1，4－5］。因此，本文通過靜脈注射硫酸黏桿菌素，使用神經(jīng)電生理手段評(píng)價(jià)其周圍神經(jīng)毒性，分析黏桿菌素對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)電生理指標(biāo)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，篩選敏感指標(biāo)，為黏桿菌素神經(jīng)毒性的機(jī)制研究及臨床神經(jīng)毒性的早期診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 BL－420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)；硫酸黏桿菌素原粉（20195 U／mg），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉，德國(guó)生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物處理 健康雄性昆明系雌性小鼠50只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正式試驗(yàn)時(shí)小鼠體重在18～22g，分為硫酸黏桿菌素處理組和對(duì)照組。試驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射黏桿菌素7.5mg／kg（10mL／kg體重），每天2次，間隔12 h，連續(xù)給藥7d，對(duì)照組注射生理鹽水。以給藥當(dāng)天為0計(jì)，在硫酸黏桿菌素處理組在初次給藥后1，3，7 d，和15d，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。常規(guī)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在（22℃±2℃），濕度（50±10）%。

1.3 步態(tài)評(píng)分 按照文獻(xiàn)［6］方法，將小鼠放在空曠的地面上，使其自主行動(dòng)，觀察3min，進(jìn)行步態(tài)評(píng)分。1分：正常步態(tài)；2分：輕微異常的步態(tài)（輕微的共濟(jì)失調(diào)，足張開，行動(dòng)吃力）；3分：中度異常的步態(tài)（明顯的共濟(jì)失調(diào)，足張開，移動(dòng)時(shí)肢外展）；4分：重度異常的步態(tài)（足張開，不能支持體重，無法站立）。

1.4 坐骨－脛神經(jīng)電生理指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)過程中，控制室溫在25℃±2℃，0.4%戊巴比妥鈉40mg／kg體重腹腔注射麻醉小鼠，使用加熱燈控制小鼠體溫。暴露小鼠左后肢坐骨神經(jīng)干，覆蓋溫?zé)崾炗?，并連接鉤狀刺激電極，記錄針電極連接腳踝及小鼠第1趾間肌肉，接地電極連接刺激電極與記錄電極之間的皮膚上。將動(dòng)物后足以自然肢體狀態(tài)與脊柱成45°夾角向斜后方拉直，沿坐骨神經(jīng)經(jīng)過部位和方向，在動(dòng)物體表準(zhǔn)確測(cè)定刺激電極到記錄電極之間的距離（s），潛伏期為刺激偽跡起始部至動(dòng)作電位起始部之間的時(shí)間（t）根據(jù)v＝s／t，計(jì)算 NCV。剛開始出現(xiàn)動(dòng)作電位波形時(shí)的刺激強(qiáng)度為閾刺激強(qiáng)度（TP）、動(dòng)作電位波形達(dá)到最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的刺激電位為最大刺激強(qiáng)度（MI）、動(dòng)作電位起始至結(jié)束間時(shí)間為復(fù)合動(dòng)作電位時(shí)程（CAPD）、刺激偽跡起始部與動(dòng)作電位起始部之間的距離為復(fù)合動(dòng)作電位潛伏期（CAPL）、波峰波谷的高度差為復(fù)合動(dòng)作電位波幅（CAPA）。所有指標(biāo)在30min內(nèi)完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)通過Mean±SD表示，對(duì)小鼠體重變化進(jìn)行t檢驗(yàn)；電生理參數(shù)、步態(tài)評(píng)分使用SPSS11.5One－Way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般毒性觀察 小鼠每次給藥后表現(xiàn)出興奮不安，隨后逐漸呆滯不動(dòng)，此后腹式呼吸明顯，約10min后呼吸基本恢復(fù)正常。在第4天第1次給藥后，1只小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的抽搐，伏地不起，后緩慢恢復(fù)。從小鼠初次給藥后第4天起，試驗(yàn)組大部分小鼠表現(xiàn)出精神抑郁，活動(dòng)減少，后肢無力，直至初次給藥后第10天后，部分小鼠精神狀態(tài)逐漸開始恢復(fù)，至15d時(shí)仍然有少數(shù)小鼠表現(xiàn)為精神抑郁，后肢無力。

2.2 體重變化 結(jié)果見圖1，對(duì)照組小鼠在15d內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的增長(zhǎng)，硫酸黏桿菌素組小鼠增長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，在給藥后1d后體重出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。在給藥后3、7d和15d體重較對(duì)照組下降9.28%（P＜0.05）、12.5%（P＜0.01）和11.3%（P＜0.01）。

2.3 步態(tài)評(píng)分變化 小鼠在初次給藥后1d、3d步態(tài)評(píng)分分別為1.20±0.42，1.23±0.44，較對(duì)照組（1±0）無顯著差異。至給藥7d和15d后步態(tài)評(píng)分分別為1.80±0.63（P＜0.05）和1.40±0.52（P＞0.05），較對(duì)照組差異不顯著。試驗(yàn)中，所有步態(tài)異常的小鼠，1只在第7天出現(xiàn)明顯的共濟(jì)失調(diào)，步態(tài)評(píng)分為3分，其余均為2分。

2.4 坐骨神經(jīng)－脛神經(jīng)復(fù)合神經(jīng)電生理指標(biāo)的變化

2.4.1 TP與 MI 初次給藥1、3、7、15d后，與對(duì)照組相比，硫酸黏桿菌素處理后，小鼠TP逐漸增加趨勢(shì)，分別增加為59.8%，60.5%，192.5%（P＜0.01），70.1%。MI分 別增加 3.63%，12.7%，100%（P＜0.05），29.1%（圖2）。

2.4.2 CAPA、CAPL、CAPD及 NCV 初次給藥1、3、7、15d后，與對(duì)照組相比，硫酸黏桿菌素處理后，CAPA下降，分別為0.92%、16.2%、47.6%（P＜0.01）、38.8%（P＜0.05）（圖3）；潛伏期增加，分別為9.0%，9.0%，14.6%（P＜0.05），11.2%；CAPD增加，分別為15.1%，11.5%，52.8%（P＜0.05），20.6%；NCV減低，分別為7.6%，7.5%，12.7%（P＜0.05），9.3%（圖2）。

2.4.3 波形 對(duì)照組波形正常，給藥后第1天有2只小鼠出現(xiàn)重復(fù)性動(dòng)作電位，第3、7天波形與對(duì)照組有所不同，出現(xiàn)三相動(dòng)作電位，但未見重復(fù)行動(dòng)作電位（圖3）。

圖3 靜脈注射硫酸黏桿菌素后小鼠坐骨－脛神經(jīng)復(fù)合神經(jīng)電記錄

3 討論

本試驗(yàn)中，小鼠給藥量為7.5mg／kg體重·12h相當(dāng)于臨床0.75mg／kg體重·12h。小鼠初次給藥后表現(xiàn)出一定的急性毒性癥狀［5］，腹式呼吸明顯，但10min內(nèi)得以恢復(fù)，這可能與黏桿菌素影響機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)［2，9］。小鼠步態(tài)評(píng)分趨勢(shì)、呼吸癥狀隨著給藥次數(shù)的增加而逐漸加重，可能與黏桿菌素在小鼠體內(nèi)的劑量累積及時(shí)間依賴性相關(guān)［1］。硫酸黏桿菌素給藥3d、7d后，小鼠體重顯著下降，與黏桿菌素致使小鼠食欲下降，致使其體重下降相關(guān)［5］。或與黏桿菌素的肝毒性、腎毒性相關(guān)，致使腎臟對(duì)黏桿菌素的排除障礙導(dǎo)致黏桿菌素在體內(nèi)累積造成［4，7］。

Bosso等［8］研究發(fā)現(xiàn)，臨床患者靜脈注射黏桿菌素后，29%的病人發(fā)生感覺異常、共濟(jì)失調(diào)。臨床研究表明，周圍神經(jīng)系統(tǒng)不像中樞神經(jīng)系統(tǒng)那樣有著血腦屏障的保護(hù)而更易產(chǎn)生毒性反應(yīng)，神經(jīng)電生理檢測(cè)對(duì)黏桿菌素神經(jīng)毒性的監(jiān)控具有重要意義［10］。在本試驗(yàn)中，神經(jīng)電生理指標(biāo)隨時(shí)間變化而發(fā)生時(shí)效性變化（圖2）。在連續(xù)靜脈注射硫酸黏桿菌素給藥7d后，CAPA、TP及MI顯著降低，可能與被觸發(fā)軸突的數(shù)量或神經(jīng)纖維的密度相關(guān)［6］，NCV的顯著降低，可能與黏桿菌素抑制突觸前乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放相關(guān)［9］。

黏桿菌素具脂質(zhì)A基團(tuán)模式結(jié)構(gòu)，并攜帶游離陽離子氨基酸，可與高脂質(zhì)含量神經(jīng)元相互作用，產(chǎn)生神經(jīng)毒性［1］。而神經(jīng)髓鞘的膜性結(jié)構(gòu)含有大量的不飽和脂肪酸，易受脂質(zhì)過氧化損傷，使髓鞘不完整或缺失、軸突直徑發(fā)生變化，從而導(dǎo)致膜電容和阻抗改變，致使觸發(fā)軸突的數(shù)量的減少，或者通過脂質(zhì)過氧化損傷而對(duì)神經(jīng)軸突造成損傷，從而引起一系列的神經(jīng)電指標(biāo)發(fā)生變化。黏桿菌素可引起物質(zhì)能量代謝障礙以及機(jī)體抗氧化能力的改變［11］，使細(xì)胞膜的特性發(fā)生改變；亦可能引起脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、腓神經(jīng)軸突中鉀鈉鈣氯離子的濃度改變［12］，從而對(duì)電生理指標(biāo)產(chǎn)生影響。

在第15天小鼠毒性行為癥狀有所緩和，但CAPA仍差異顯著，與 Wahby等［10］報(bào)道相似，即在病人因發(fā)生神經(jīng)毒性而停止用藥的第5天后，CAPA顯著降低，說明黏桿菌素誘發(fā)的神經(jīng)毒性具有一定的可恢復(fù)性［1，4，9］。此外，在小鼠給藥1d后，部分小鼠出現(xiàn)重復(fù)性動(dòng)作電位（圖3－B），可能與臨床多發(fā)性神經(jīng)炎相關(guān)，但在隨后的神經(jīng)電生理未見此類現(xiàn)象，有待進(jìn)一步的證實(shí)。

本試驗(yàn)表明，硫酸黏桿菌素可誘導(dǎo)小鼠坐骨－脛神經(jīng)電生理發(fā)生時(shí)效性變化，暗示黏桿菌素可造成周圍神經(jīng)毒性的發(fā)生，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。此外，CAPA指標(biāo)較為敏感，有助于臨床診斷。

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