王 開，裴志花，臧亞茹

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院，吉林 長春130118）

自2008年以來，本省部分地區(qū)育肥牛出現(xiàn)了一種以咳嗽、喘為主的疾病，剖檢死亡牛后發(fā)現(xiàn)，肺臟全部或部分糜爛，與肋骨粘連，給養(yǎng)牛戶造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響到了人們的養(yǎng)牛積極性。為了確定其病原，本文重點(diǎn)從巴氏桿菌、支原體等兩個(gè)方面，對來自不同地區(qū)的病牛進(jìn)行病原的分離和鑒定，研究其防控措施。

1 材料

1.1 病原材料 某肉牛場即將死亡的病牛1頭，某屠宰場帶有咳嗽癥狀的病牛3頭，某養(yǎng)殖戶病死牛1頭，以上病料均來自不同地區(qū)，無菌采集病牛的心臟、肺臟和肝臟。

1.2 培養(yǎng)基與生化試劑 鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、愛德華氏培養(yǎng)基，由臨床實(shí)驗(yàn)室參照參考文獻(xiàn)［6］配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康小鼠，體重20～25g，健康家兔，體重1 500～2 000g，均購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 藥敏試驗(yàn) 抗生素包括阿奇霉素（AZM）、頭孢噻肟鈉（CTX）、替米考星（TMS）、頭孢曲松鈉（CRO）、硫酸新霉素（NEO）、環(huán)丙沙星（CIP）、酒石酸泰樂菌素（TEL）、氟苯尼考（FBK）、卡那霉素（KAN），藥敏紙片的制備均按照NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）的標(biāo)準(zhǔn)由臨床實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 臨床癥狀檢查 對出現(xiàn)咳嗽、喘的病牛進(jìn)行臨床癥狀檢查。

2.2 病理剖檢 對以咳嗽、喘為主要癥狀死亡的病牛進(jìn)行剖檢，觀察其主要病理變化。

2.3 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

2.3.1 涂片染色鏡檢 將病料組織觸片進(jìn)行瑞氏染色和革蘭染色，鏡檢觀察染色特性及形態(tài)特征。

2.3.2 分離培養(yǎng) 無菌采集瀕死期病牛的心血、肺臟、肝臟，分別接種于腦心浸液肉湯，置恒溫箱37℃增菌培養(yǎng)24h后，首先是接種于鮮血瓊脂平板和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況、菌落形態(tài)以及是否溶血。挑選典型的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接于血瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化。其次是接種于愛德華氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間在48h以上，觀察是否有支原體的生長。

2.3.3 生化鑒定 分離菌的生化鑒定按常規(guī)方法進(jìn)行，參照參考文獻(xiàn)［6］。

2.3.4 動(dòng)物試驗(yàn) 取健康小鼠15只，隨機(jī)分為2組，第1組12只分別腹腔注射菌量為103、105、107、109，每個(gè)菌量注射3只小鼠；第2組3只腹腔注射無菌生理鹽水作對照組，逐日觀察發(fā)病死亡情況。給2只兔進(jìn)行腹腔注射，觀察病變情況。

2.3.5 藥敏試驗(yàn) 用K－B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，判定依照NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.6 治療性試驗(yàn) 利用篩選到的敏感性藥物，對臨床病例進(jìn)行治療，觀察治療效果。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀觀察 病牛發(fā)熱，體溫升高達(dá)40℃～42℃，食欲減退，反芻遲緩，腹式呼吸，呼吸頻率為60～90次／min。多數(shù)牛干咳，每次連續(xù)1～2聲，發(fā)出“吭吭”的聲音。病牛呼吸急促，少量流涎，舌面有潰瘍，結(jié)膜潮紅，并排出漿液性白泡樣鼻汁。隨著病情發(fā)展，部分病牛出現(xiàn)拉稀，甚至血便。個(gè)別病牛出現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)膿腫等，最終逐漸消瘦，甚至衰竭死亡。

3.2 病理剖檢觀察 眼觀病理變化以肺臟變化最明顯，4／5的肺臟發(fā)生肉變，質(zhì)地較硬，小葉間結(jié)締組織漿液性水腫而增寬，切面呈大理石樣花紋；有的病牛肺臟大部分和縱膈、胸腔粘連，胸腔內(nèi)有大量膿液，甚至一側(cè)肺葉成為一大膿腫肺。真胃潰瘍，其他未見異常。

3.3 細(xì)菌學(xué)診斷

3.3.1 細(xì)菌形態(tài)觀察 病死牛的肺臟、肝臟、心血觸片瑞氏染色鏡檢，可見大量兩極濃染的短桿菌，革蘭染色可見革蘭陰性的小桿菌。

3.3.2 病原菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性 分離菌在普通瓊脂上生長貧瘠，在麥康凱瓊脂上不生長。在鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)灰白色、光滑濕潤、邊緣整齊的水滴樣小菌落，無溶血現(xiàn)象，革蘭染色為陰性桿菌。愛德華氏培養(yǎng)基上未見菌落生長。

3.3.3 生化鑒定結(jié)果 見表1。

表1 生化鑒定結(jié)果

3.3.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 不同濃度菌懸液腹腔注射小鼠后10只小鼠在36h內(nèi)全部死亡，其中注射菌量為105、107、109的小鼠在12h內(nèi)死亡，對照組小鼠正常，剖檢死亡小鼠，瑞氏染色鏡檢可見兩極濃染的巴氏桿菌。腹腔注射菌懸液的3只家兔在注射后3d死亡，對照組家兔正常。剖檢可見死亡家兔肺組織纖維素性滲出，心包膜與胸膜粘連，取心血、肝、肺涂片，瑞氏染色鏡檢可見兩極濃染的巴氏桿菌。

3.3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 依照NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）標(biāo)準(zhǔn)，最敏感的藥物為硫酸新霉素（NEO），其次依次為阿奇霉素（AZM）、頭孢曲松鈉（CRO）、頭孢噻肟鈉（CTX），而替米考星（TMS）、環(huán)丙沙星（CIP）、酒石酸泰樂菌素（TEL）、氟苯尼考（FBK）、卡那霉素（KAN）均不敏感。

3.3.6 治療結(jié)果 使用硫酸新霉素和頭孢曲松鈉進(jìn)行早期的治療，效果顯著，但對于晚期病例，效果不理想。

4 分析討論

我國2008年首次報(bào)道從犢牛肺臟中分離到牛支原體［5］，由于目前我國對 M.bovis監(jiān)視的低估，導(dǎo)致牛支原體引起的疾病在我國已經(jīng)普遍發(fā)生。根據(jù)我國部分文獻(xiàn)顯示，自2008年以來，我國部分地區(qū)從外地新引進(jìn)的肉牛都暴發(fā)了牛支原體肺炎，其發(fā)病率為50%，病死率高達(dá)10%～50% ，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國家有關(guān)部門的高度重視［7－8］。因此，本試驗(yàn)也進(jìn)行了支原體的分離培養(yǎng)，但未分離到該病原。由于支原體非常難培養(yǎng)，本次試驗(yàn)是否存在假陰性，在將來的試驗(yàn)中還要進(jìn)一步研究。

從主要臨床癥狀和剖檢變化上看，類似于多殺性巴氏桿菌（Pm），但與以往不同的是此次發(fā)病死亡的育肥牛在剖檢過程中并未發(fā)現(xiàn)有明顯的內(nèi)臟器官的出血性炎癥及各漿膜黏膜出血，而是以肺部化膿感染或肉變?yōu)橹饕卣鳎野l(fā)病率和死亡率都高于以往。本試驗(yàn)從不同地區(qū)采集的病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)共獲得5株分離菌，分離株在血瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊的露珠樣菌落，形態(tài)特征及培養(yǎng)特性與以往引起成年牛敗血病癥狀的巴氏桿菌相符；分離菌株生化鑒定結(jié)果與多殺性巴氏桿菌的生化特性一致。將分離的純培養(yǎng)物注射小鼠表現(xiàn)出高度致病性，在注射分離株純培養(yǎng)物的家兔體內(nèi)分離到相同的細(xì)菌，故鑒定為多殺性巴氏桿菌感染。

受牛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和其他因素的影響，采集病死牛的病料變得十分困難，因此本試驗(yàn)嘗試了采集病牛的鼻液，但分離到的都是一些雜菌，未培養(yǎng)到Pm和支原體，說明本病的細(xì)菌分離培養(yǎng)還是以瀕死病牛的心血、肝血為主，尤其是化膿的肺臟最好。在國內(nèi)近年來有過關(guān)于牛巴氏桿菌病的報(bào)道，如李平安等報(bào)道了巴氏桿菌引起犢牛死亡的病例［9］，馬文戈等［10］首次報(bào)道在2008年東北地區(qū)部分牛場出現(xiàn)由莢膜A型Pm引起犢牛死亡，顯示我國新出現(xiàn)了牛源莢膜血清A型Pm。馬曉菁等在新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)了由莢膜A型血清型引起的犢牛死亡且表現(xiàn)癥狀與以往的敗血性不同，主要表現(xiàn)為肺部感染、腹瀉，造成犢牛急性死亡［11］。

從發(fā)病原因來看，主要是從外地購牛、運(yùn)輸應(yīng)激及天氣突變，導(dǎo)致個(gè)別牛出現(xiàn)咳嗽、喘等臨床癥狀；東北地區(qū)冬季寒冷、牛舍氨氣等有害氣體嚴(yán)重超標(biāo)、通風(fēng)不良、濕度大等加劇了病情；“自繁自養(yǎng)”、病牛隔離飼養(yǎng)、圈舍消毒等簡直是空談，私宰濫宰等不正之風(fēng)導(dǎo)致本病迅速傳播。針對以上問題，我們應(yīng)采取正確的防控措施。首先，新引進(jìn)的牛一定要隔離飼養(yǎng)，發(fā)病牛及時(shí)隔離或淘汰，以防病原感染健康?；蚶^發(fā)感染；加強(qiáng)防疫意識，嚴(yán)把注射器消毒和牛舍消毒等環(huán)節(jié)，以減少疾病的傳播；加強(qiáng)圈舍的保溫、通風(fēng)設(shè)計(jì)，營造一個(gè)良好的飼養(yǎng)環(huán)境。其次，摸索一個(gè)適合本地區(qū)、本養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)模式。目前我們還很難擺脫人畜混居的局面，或者說我們養(yǎng)殖的大環(huán)境并不理想，導(dǎo)致一些疾病時(shí)有發(fā)生，因此建議飼養(yǎng)規(guī)模不宜太大。最后，從試驗(yàn)結(jié)果來看，使用硫酸新霉素和頭孢曲松鈉等藥物比較敏感。發(fā)病牛要早期治療，對于發(fā)燒40℃以上的病牛，最好靜脈注射，但輸液的速度一定要慢，否則容易引起肺水腫及心臟負(fù)擔(dān)過大而出現(xiàn)心律失常。

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