王維剛，王志剛，李大鵬

（吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院，吉林 吉林132013）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于骨髓的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)，具有自我更新能力；在一定的誘導(dǎo)條件下，MSCs具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多向分化的能力［1］。同時(shí)因其具有取材方便，易于分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增快，且自體骨髓干細(xì)胞移植不易產(chǎn)生免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)而備受重視，成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究骨肽對(duì)體外培養(yǎng)MSCs不同時(shí)間點(diǎn)TGF－β1表達(dá)的影響，初步探討骨肽在促進(jìn) MSCs成骨分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑 DMEM－L培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Percoll（密度1.073g.mL－1，Pharmacia）；骨 肽 （黑 龍 江 江 世 藥 業(yè) 有 限 公 司）TGF－β1 ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MSCs培養(yǎng)與鑒定參考已發(fā)表的文章［2］，將分離獲得的第三代MSCs用含10%胎牛血清的DMEM－L，置于培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3.2 骨肽對(duì)MSCs表達(dá)的影響 待MSCs融合至85%，胰酶消化，計(jì)數(shù)活細(xì)胞以每孔1×106接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的骨肽（0.002mg／ml、0.008mg／ml、0.032mg／ml），對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別在1d、3d、5d、7d利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF－β1的含量。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，骨肽濃度為0.002mg／ml時(shí)，細(xì)胞上清中TGF－β1含量有無明顯改變。隨著骨肽濃度增高，TGF－β1的表達(dá)含量有增高的趨勢(shì)，0.008mg／ml組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05；0.032mg／ml劑量組與對(duì)照組相比時(shí) TGF－β1增高更加明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P＜0.01）。0.008 mg／ml和0.032mg／ml劑量組培養(yǎng)5d、7dTGF－β1含量與1d、3d相比有下降趨勢(shì)。

表1 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對(duì)MSCs TGF－β1含量的影響（±s）

表1 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對(duì)MSCs TGF－β1含量的影響（±s）

與對(duì)照組相比＊P＜0.05，ΔP＜0.01；

骨肽（mg／ml）1in MSCs 1（t／d） 3（t／d） 5（t／d） 7（t／d）TGF－β對(duì)照組0.18±0.02 0.18±0.01 0.19±0.02 0.18±0.00 0.002 0.20±0.01 0.22±0.02 0.21±0.02 0.22±0.00 0.008 0.33±0.01＊0.35±0.03＊0.29±0.02＊ 0.30±0.02＊0.032 0.48±0.02Δ 0.45±0.02Δ 0.39±0.03Δ 0.40±0.01Δ

3 討論

MSCs的多向分化潛能及其體外增殖力強(qiáng)，大量傳代培養(yǎng)后仍具有很強(qiáng)的成骨能力等優(yōu)點(diǎn)成為骨組織工程的首選種子細(xì)胞。以往研究表明，MSCs的定向分化成骨仍是通過外部物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑使用大多是激素、細(xì)胞因子之類［3－5］，開發(fā)新型安全有效的MSCs成骨分化誘導(dǎo)劑，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

TGF－β可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生并以自分泌的形式對(duì)成骨細(xì)胞的復(fù)制和基質(zhì)的合成起雙向調(diào)節(jié)作用，尤其TGF－β1是骨骼中重要的傳導(dǎo)物質(zhì)之一［6］。既往的實(shí)驗(yàn)研究表明TGF－β1能促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖；且TGF－β1還能增加成骨細(xì)胞定向遷移的能力，這在骨再建過程中吸收成骨細(xì)胞前祖向激活的骨吸收部位移動(dòng)，有重要的趨化作用，骨微環(huán)境中潛在的TGF－β1激活對(duì)于調(diào)節(jié)控制骨再建過程中有十分重要的作用［7］。

骨肽是從中經(jīng)高科技生物技術(shù)精制提取的一種新型骨病治療藥物，內(nèi)含有多種與骨代謝有關(guān)的生長(zhǎng)因子及鈣、磷等元素，具有廣泛的生物學(xué)活性，在體內(nèi)可參與骨鈣的吸收和釋放，調(diào)節(jié)骨代謝的平衡，促進(jìn)骨痂和新血管的形成，因此在臨床上廣泛應(yīng)用于骨折和骨折疏松的治療。

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測(cè)骨肽作用后MSCs細(xì)胞上清中 TGF－β1蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)0.002mg／ml組與對(duì)照組相比，各時(shí)間段 TGF－β1蛋白無明顯改變，而0.008mg／ml和0.032mg／ml兩組各時(shí)間段表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且0.032mg／ml劑量組TGF－β1表達(dá)量與0.008mg／ml相比有增高趨勢(shì)。此結(jié)果顯示，在各時(shí)間段骨肽對(duì)MSCs TGF－β1的表達(dá)從無明顯作用到刺激增強(qiáng)，提示骨肽影響MSCs TGF－β1的表達(dá)具有劑量依賴效應(yīng)。在本研究中，0.008mg／ml和0.032mg／ml兩個(gè)劑量組在5d和7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)TGF－β1表達(dá)量與1d和3d比較有下降趨勢(shì)，考慮與在3d時(shí)已經(jīng)有足夠的TGF－β1表達(dá)并啟動(dòng)下游信號(hào)分子引導(dǎo) MSCs分化，或者與在此時(shí)間MSCs已達(dá)到最大增殖并有部分發(fā)生凋亡有關(guān)，有關(guān)這部分機(jī)制研究需要進(jìn)一步探討。

［1］Premjit Arpommaeklong，Shelley E，Brown，Zhuo Wang，et al.Phenotypic characterization，osteoblastic differentiation and bone regeneration capacity of human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells Dev，2009，18（7）：1.

［2］郭新，趙東海，何旭，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，31（3），469.

［3］Oreffo RO，Triffitt JT.Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics［J］.Bone，1999：25（2 supply）：5.

［4］Maniatopoulos C，Sodek J，Melcher A H，Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats［J］.Cell Tissue Res，1988，：254（2）：317.

［5］Gronthos S，Zannettino A C，Hay Sjpurified，et al.Molecular and cellular characterization of highly stromal cells derived from human bone marrow［J］.J Cell Sci halford K W，2003，116（9）：1827.

［6］Choi EM，Suh KS，Kim YS，et al.Soybesb ethanol extract increases the function of osteoblastic MC3T3－E1cell［J］.Phyto chemismtry 2001，56（7）：733.

［7］Randy N，Rosier M D，Ragis J，et al.The potential role of transforming growth factor bata in fracture healing［J］.Clin Orthop ＆ Res，1998，355：294.