馬傳香，高昆山，劉樹剛，李 騫，王樹慶

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊261031）

大多數(shù)急性白血病和慢性粒細(xì)胞性白血病外周血中的白細(xì)胞增高，而部分急性白血病外周血白細(xì)胞不增高，甚至減少。髓血屏障（marrow blood barrier，MBB）作為骨髓中成熟血細(xì)胞、外周血中的造血干細(xì)胞以及其它物質(zhì)出入骨髓所必須經(jīng)過的通路，是白血病細(xì)胞由骨髓入血的屏障，白血病時(shí)其調(diào)節(jié)機(jī)制究竟發(fā)生了那些變化？相關(guān)文章報(bào)道較少。二十年來，大量研究證實(shí)，血管新生在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。血管新生受多種特異性調(diào)控因子的影響，包括血管內(nèi)皮生長因子（vascular endotheliai cell growth factor。VEGF），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bovine basic fibroblast growth factor，bFGF），腫瘤生長因子等［1］。Thomas等［2］認(rèn)為，粘附分子在正常造血調(diào)節(jié)中起重要作用，造血祖細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用決定了造血細(xì)胞是否從骨髓微環(huán)境中釋放。為此，本課題通過檢測 VEGF、bFGF、sICAM－1及CD105在白血病的表達(dá)情況，探討白血病時(shí)血管新生調(diào)控因子對髓血屏障調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 本院初診未治白血病患者61例，男38例，女23例，中位年齡41（12－85）歲。急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）14例（T－ALL3例，B－ALL11例），急性髓系白血?。ˋML）35例（M12例，M212例，M36例，M43例，M512例）和慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）8例；慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）4例；其中，外周血白細(xì)胞＞100×109／L為高白細(xì)胞白血病組（52例），＜100×109／L低白細(xì)胞白血病組（9例，其中T－ALL2例，M21例，M34例 ，M52例，）；所有病例符合MICM診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組20例，為查體健康者，男16例，女4例，中位年齡32.5歲。

1.2 抗凝骨髓液及骨髓涂片制備 取骨髓液2 ml，一份注入含5%EDTA干粉管抗凝，標(biāo)本在30 min內(nèi)2000r／min，分離10min，吸取上層液，置－80℃凍存。一份滴至多聚賴氨酸處理的玻片上，制備新鮮涂片2張，并及時(shí)用4%多聚甲醛／0.MPBS（pH7.2－7.6），含 1／1000DEPC（抑 制 RNA 酶 對mRNA的分解）的固定液固定30分鐘，蒸餾水充分洗滌，干燥后－20℃保存。

1.3 方法 （1）CD105原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，用于檢測骨髓涂片標(biāo)本的CD105的mRNA序列，針對人的CD105靶基因的 mRNA 序 列 為 ①5’－TTCT CATGC TGGAA GCCAG CCAGG ACATG GGCCG－3’；② 5’－CATCG ACGCC AACCA CAACA TGCAG ATCTG GACCA－3’；③5’－TCCAG ACAAA GTGTG CCGAC GACGC CATGA CCCGA－3’；嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)果判定陽性細(xì)胞胞漿著色為棕黃色顆粒狀，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察10個高倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞。計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。（2）VEGF、bFGF、sICAM－1酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked－lmmunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。用自動酶標(biāo)分析儀讀取吸光度（A）值，根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)所得的標(biāo)準(zhǔn)品的A值，相應(yīng)濃度，應(yīng)用Curve Expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求得骨髓液 VEGF，bFGF，sICAM－1濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，采用t檢驗(yàn)，直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD105在不同類型白血病的表達(dá) CD105在白血病的表達(dá)以急性髓系白血?。ˋML－M5）最高，急性髓系白血?。ˋML）AML－M3表達(dá)最低。AML－M5的陽性表達(dá)率為［（52.32±15.34）%］明顯高于正常對照組 ［（2.32±0.87）%］（P＜0.05）；AML－M3的陽性表達(dá)率為 ［（3.56±1.21）%］與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CLL陽性表達(dá)率與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其他白血?。═－ALL、B－ALL、M1、M2、M4、CML）的陽性表達(dá)率均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；CD105在高白細(xì)胞白血病組的表達(dá)明顯高于在低白細(xì)胞白血病組的表達(dá)（P＜0.05）；結(jié)果見表1；部分白血病陽性結(jié)果如圖1－6示。

圖1－6 分別為T－ALL、B－ALL、AML－M3、AML－M5、CML、CLL

表1 不同白血病分組CD105的表達(dá)

2.2 不同類型白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sI－CAM－1含量 骨髓液VEGF、sICAM含量在CML表達(dá)最高，bFGF在 B－ALL表達(dá)最高，VEGF、sICAM而含量在T－ALL明顯高于與正常對照組（P＜0.05）；bFGF含量在 T－ALL與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CLL表達(dá) VEGF、bFGF與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CLL表達(dá)sICAM明顯高于正常對照組；其他白血?。˙ALL、M1、M2、M3、M4、M5、CML）VEGF、bFGF、sICAM均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；VEGF、sICAM在高白細(xì)胞白血病組的表達(dá)明顯高于在低白細(xì)胞白血病組的表達(dá)（P＜0.05）；而bFGF在高白細(xì)胞白血病組與低白細(xì)胞白血病組的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表達(dá)情況（±S，ng／L）

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表達(dá)情況（±S，ng／L）

注：與正常對照比較：P＜0.05，＊P＞0.05；高、低白細(xì)胞組比較：#P＜0.05，##P＞0.05。

VEGF bFGF sICAM－1 T細(xì)胞型 3 185.63±38.12＊ 8.50±5.41 175.51±76.52組別 例數(shù)＊20 111.23±73.28 7.33±3.21 159.62±48.89 B細(xì)胞型 11 460.20±143.35 32.35±17.65 497.56±154.12 M1 2 283.54±58.32 16.57±7.58 458.62±195.34 M2 12 321.33±78.66 18.42±9.87 386.79±154.37 M3 6 356.74±113.50 26.10±13.46 285.69±132.62 M4 3 376.57±83.64 21.67±12.65 426.87±186.70 M5 12 485.36±143.21 22.73±11.79 563.45±198.61 CML 8 528.35±137.67 28.56±18.46 587.62±147.29 CLL 4 122.32±61.65＊ 9.54±6.15＊ 487.69±167.54高白細(xì)胞組 52 398.77±127.18# 19.46±13.67## 532.37±176.93#低白細(xì)胞組 9 216.73±62.47 20.36±7.83 228.56±98.92正常對照組

2.3 CD105與 VEGF、bFGF、sICAM 的表達(dá)的相關(guān)性分析 骨髓液CD105在AML－3的表達(dá)與VEGF、bFGF、sICAM的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在其他類型白血病與VEGF、bFGF、sICAM 的表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

MBB的功能單位是髓竇，它是由連續(xù)的內(nèi)皮層，間斷的基膜層和外膜層構(gòu)成，髓竇聯(lián)絡(luò)成網(wǎng)，埋在纖維母細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)。髓竇之間是造血組織，髓竇的內(nèi)皮層是由一層連續(xù)排列的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成竇腔?；な怯蓛?nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。外膜層是由廣泛間斷地覆蓋在內(nèi)皮層外面的外膜細(xì)胞構(gòu)成，屬纖維母細(xì)胞。其覆蓋程度稱外膜細(xì)胞覆蓋率（ACCR）。ACCR參考值為60～65%［4］。關(guān)于血細(xì)胞出髓的機(jī)制十分復(fù)雜，既與MBB的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，也和造血微環(huán)境的生化變化及各種造血調(diào)控因子的作用密切相關(guān)。

研究證實(shí)血管新生在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的分裂原，能特異地刺激內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與增殖，促進(jìn)血管的生長。bFGF是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）超家族成員，為重要的血管生成因子，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，從而促進(jìn)腫瘤血管生成［4］；Dias［5］等證實(shí)白血病分泌的bFGF可引起內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF，VEGF與bFGF有協(xié)同作用。國外大量實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，CD105在新生的內(nèi)皮細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)志之一［6］。在白血病的發(fā)生過程中，粘附分子的數(shù)量和親和力的變化起重要作用，粘附分子的相互作用促進(jìn)了白血病細(xì)胞的增殖。同時(shí)粘附分子可以改變白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為，導(dǎo)致其浸潤和擴(kuò)散的發(fā)生［2］。

本研究結(jié)果顯示骨髓液CD105、VEGF、bFGF、sICAM 在B－ALL、M1、M2、M4、M5、CML均存在較高表達(dá)，臨床上大多數(shù)白血病骨髓中高增殖的白血病細(xì)胞與外周血白血病細(xì)胞往往呈現(xiàn)正相關(guān)。Nagaoka T［7］使用透射電鏡在各種白血病時(shí)，其外周血中的白細(xì)胞增高則除與骨髓腔內(nèi)無限增殖的白血病細(xì)胞所導(dǎo)致的髓腔壓力增高，使隔膜孔擴(kuò)大易于突破髓血屏障等之外，還與外膜細(xì)胞覆蓋率明顯減低有關(guān)。原因可能為腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，是這些細(xì)胞因子相互作用，影響了髓血屏障的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)機(jī)制，CD105與VEGF高表達(dá)刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，bFGF高表達(dá)刺激纖維母細(xì)胞的生長，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移，兩者的表達(dá)量的平衡影響髓血屏障內(nèi)皮層內(nèi)皮細(xì)胞與外膜層纖維母細(xì)胞數(shù)量的平衡，影響著髓血屏障外膜覆蓋率，影響著出髓細(xì)胞的數(shù)量。所以，外周血中白細(xì)胞數(shù)增高機(jī)制除與白血病細(xì)胞無限增殖、白血病性干細(xì)胞的髓外增殖有關(guān)外，還與髓血屏障的嚴(yán)重受累有重要關(guān)系。

在 AML－3，CD105與 VEGF、bFGF、sICAM 的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，CD105呈低表達(dá)，VEGF、bFGF、sICAM呈較高表達(dá)，臨床常常表現(xiàn)為骨髓增生極度活躍而外周血表現(xiàn)全血細(xì)胞減少，可能為髓血屏障內(nèi)皮層內(nèi)皮細(xì)胞與外膜層纖維母細(xì)胞數(shù)量的平衡未被完全打破所致。

在B－ALL CD105、VEGF、bFGF、sICAM 的表達(dá)水平均位于高值，而在T－ALL CD105、VEGF的表達(dá)較正常增高，而bFGF得表達(dá)與正常無明顯差別，而臨床上T－ALL往往表現(xiàn)高白細(xì)胞血癥和縱膈及其他組織的腫塊，可能與CD105、VEGF增高，bFGF正常表達(dá)，致使血管生成在髓血屏障的調(diào)節(jié)平衡被打破，觸發(fā)白血病細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。B－ALL臨床往往表現(xiàn)骨髓液流動性差、粘稠而不易抽取，推測原因可能為CD105、VEGF、bFGF、sICAM平行性增高，使血管生成與抗血管生成的平衡未被完全破壞，相對高增殖的白血病細(xì)胞，未有足夠的血管供應(yīng)造成。在CLL CD105、VEGF、bFGF的表達(dá)與正常對照無明顯差別，而sICAM表達(dá)較高，臨床上骨髓CLL白血病細(xì)胞與外周血白血病細(xì)胞往往呈現(xiàn)一致性，可能為成熟淋巴細(xì)胞分泌CD105、VEGF、bFGF的量少有關(guān)。而sICAM的升高，競爭性的結(jié)合細(xì)胞表面受體，因而使細(xì)胞間粘附減少，使骨髓的白血病細(xì)胞釋放到外周血的細(xì)胞數(shù)量升高。

bFGF在高白血病組與低白血病組的表達(dá)量無明顯差異，推測原因可能為，bFGF在不同白血病的分泌量比CD105與VEGF、sICAM的分泌量低有關(guān)。但通過bFGF在 AML－M3、T－ALL、CLL的表達(dá)情況看，bFGF對髓血屏障有著較為重要的作用，與調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞出髓有重要的關(guān)系。

總之，研究表明不同白血病患者存在不同程度的血管新生因子的異常表達(dá)，CD105、VEGF、bFGF、sICAM參與構(gòu)成了骨髓內(nèi)的誘導(dǎo)微環(huán)境，影響造血細(xì)胞的粘附、增殖和分化，影響髓血屏障的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制，使髓血屏障調(diào)節(jié)平衡被打破，觸發(fā)白血病細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，在調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的生長、分化及細(xì)胞出髓、入髓中起重要作用。

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