張 晶，李衛(wèi)凱，謝志威，劉健婷，梁齊合，何成彥，趙海豐

（1.江門市中心醫(yī)院 檢驗科，廣東 江門529070；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.佳木斯大學第一附屬醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003）

大腸癌是當前嚴重危害人類健康的惡性腫瘤。全世界每年大約有100萬大腸癌新發(fā)例，49.2萬人死于大腸癌［1］。近年來，大腸癌的診斷及綜合治療水平取得了很大的進展，但其發(fā)病率和死亡率并未發(fā)生根本性的變化，因此大腸癌復雜的發(fā)病機制需要繼續(xù)不斷的研究。Desmin是一種重要的細胞骨架蛋白，在維持細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和胞外基質(zhì)聯(lián)結(jié)中起重要的作用。近年來細胞骨架蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生和侵襲中起的作用逐漸受到重視，骨架蛋白在各種惡性腫瘤中的研究也成為熱點，但是關(guān)于Desmin在惡性腫瘤中的研究較少，為此本文應用蛋白質(zhì)組學中的先進技術(shù)－液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究了Desmin在大腸癌及癌旁組織中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集佳木斯大學第一附屬醫(yī)院18例手術(shù)治療的大腸癌患者的腫瘤組織標本均經(jīng)病理學檢查證實及各患者距離腫瘤組織邊緣10cm以外的上端癌旁組織標本，術(shù)前均經(jīng)患者同意?；颊咝g(shù)前均未接受任何治療，年齡49－78歲，中位年齡57歲，其中男13人，女5人。將所獲得的新鮮標本離體后用生理鹽水沖洗干凈后，放入液氮冷凍，－80℃保存。

1.2 主要試劑

Bio－Rad公司的碘代乙酰胺（IAA）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、3－［（3－膽酰胺丙基）－二 乙胺］－丙磺酸（CHAPS）、碳酸氫氨、苯甲基磺酰氟（PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超純水、安捷倫公司的1200納升級液相色譜分析儀和賽默飛世爾公司的LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。

1.3 實驗方法

（1）組織總蛋白質(zhì)的提取及蛋白濃度分析：對組織標本進行研磨，裂解，低溫勻漿，離心，將蛋白上清液吸出備用，使用核酸蛋白分析儀檢測后利用標準曲線分析計算蛋白濃度。

（2）組織蛋白水解多肽混合物的制備：提取的組織蛋白用25mM NH4HCO3稀釋，使尿素濃度低于2M，加入1M的DTT，充分混勻，使其終濃度為20 mM，56℃下還原1h后降至室溫加入1M的碘乙酰胺混勻使其終濃度為50mM，常溫下避光反應30分鐘，按1∶50加入測序級胰酶37℃酶切過夜。

（3）二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)庫檢索：將所有樣品用緩沖液A溶解，各取50μg樣本上樣經(jīng)反相色譜洗脫的多肽應用LTQ XL質(zhì)譜儀檢測，核質(zhì)比檢測范圍為400－2000amu，應用數(shù)據(jù)依賴方式進行次二級質(zhì)譜掃描。

（4）應用實驗中每個蛋白的譜圖數(shù)來評價其豐度。對于在不同樣品中豐發(fā)生變化的蛋白，其譜圖數(shù)變化必須滿足以下原則：1、兩個樣品中譜圖數(shù)的比值大于等于1；2、兩個樣品中譜圖數(shù)的差值大于等于72（平均每次實驗差值為24）。每個樣品進行三次實驗，然后將結(jié)果相互比較分析，將腫瘤與癌旁組織的蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果進行比對，將得到的有顯著差異的蛋白，挑選出Desmin進行免疫印跡實驗驗證準確性。

1.4 統(tǒng)計學分析

液質(zhì)聯(lián)用圖譜依據(jù)SEQUEST算法，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗。P＜0.05為有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定出在腫瘤組織中與癌旁組織中表達有顯著差異蛋白，結(jié)果見表1。

表1 二維色譜與質(zhì)譜鑒定的有顯著差異的腫瘤組織下調(diào)蛋白

2.2 本文著重探討Desmin蛋白，Desmin蛋白免疫印跡結(jié)果見下圖。

圖中AB分別代表癌旁組織及癌組織，表明Talin在腫瘤組織中較癌旁組織中表達降低，具有顯著性差異。

3 討論

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其生長、轉(zhuǎn)移、復發(fā)是一個連續(xù)過程，因此，闡明大腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制及其影響因素是目前腫瘤研究的重大課題。以往很多研究證明大腸癌的生長是個復雜的多基因參與的多步驟過程，明確其相關(guān)基因及蛋白質(zhì)的作用，研究其發(fā)生和發(fā)展的機制，篩選和鑒定大腸癌生物學標志物，從而在腫瘤治療取得突破，也就成為腫瘤研究的最前沿領(lǐng)域和熱點。腫瘤蛋白質(zhì)組技術(shù)為實現(xiàn)上述研究提供了可靠的新技術(shù)。

正常細胞中細胞骨架穩(wěn)定，細胞運動很少，癌變的細胞細胞骨架破壞，細胞運動增加［3］，這是癌細胞突出特點，向外圍組織侵襲，細胞遷移運動調(diào)節(jié)機制在此過程中起重要作用。結(jié)蛋白是476個氨基酸構(gòu)成的一種高度保守的肌肉組織中間絲蛋白，包括一個起調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的氨基端，一個含有二聚化結(jié)合位點的羧基端，和一個α螺旋的桿狀體區(qū)，其中桿狀體區(qū)又分成1A、1B、2A和2B四個結(jié)構(gòu)域［2］。結(jié)蛋白通過網(wǎng)格蛋白連接于肌原纖維的Z線，使鄰近的肌原纖維彼此連接，起到動力傳導作用。同時把肌原纖維與細胞核、肌膜下細胞骨架和胞漿內(nèi)的細胞器連接，起到細胞內(nèi)信號傳導作用。目前，Desmin在肌病、肌源性腫瘤研究較多，而在惡性腫瘤方面研究不是很多，朱雪瓊等［3］研究發(fā)現(xiàn)Desmin在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤較富于細胞平滑肌瘤之間差異有高度顯著性，在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤中表達較富于細胞平滑肌瘤降低；張汝玲等［4］研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中Desmin表達呈強陽性；Cheng Wu等［5］通過雙向凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Desmin在胃癌較癌旁組織中表達增加；Ma，LY［6］通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)在篩選大腸癌腫瘤標志物時發(fā)現(xiàn)Desmin在大腸癌中表達增加。本研究采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)中的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測了Desmin蛋白在大腸癌組織與癌旁組織中的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)Desmin蛋白在大腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，提示Desmin低表達與大腸癌癌變有關(guān)。盡管有關(guān)Desmin的研究結(jié)果存在分歧，但都說明了Desmin在腫瘤發(fā)生中起一定的作用，具體機制目前還不清楚，因此，Desmin蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生機制仍需要進一步深入的研究。

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［2］Sharma S，Mücke N，KatusHA，et al.Disease mutations in the“head”domain of the extra－sarcomeric protein desmin distinctly alter its assembly and network－forming properties［J］.J Mol Med，2009，87（12）：1207.

［3］朱雪瓊，石一夏，趙承洛.子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤特異性標志物的研究［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2003，12（5）：354.

［4］張汝玲，王興鵬，吳 愷，等.胰腺星狀細胞在胰腺癌組織中的激活及其可能作用［J］.胰腺病學，2002，2（1）：45.

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