李 妍，王 海，張 鐸，李 瑤，曹慧玲

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林132013；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院科研處，吉林 吉林132013）

針對(duì)凋亡細(xì)胞的生物化學(xué)改變［1］，已經(jīng)建立了多種基于FCM來(lái)檢測(cè)凋亡的方法。其中，碘化丙啶單染（propidium iodide，PI）單染法和 PI／AnnecxinⅤ 雙染法應(yīng)用最為廣泛［2］。雙染法可精確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞。雖然PI單染法僅能檢測(cè)到晚期凋亡和壞死細(xì)胞，但因操作簡(jiǎn)單、試劑廉價(jià)，更適合樣本量大的預(yù)實(shí)驗(yàn)或新藥篩選。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)、收集和染色等環(huán)節(jié)，存在多處影響檢測(cè)結(jié)果的因素。本文以貼壁生長(zhǎng)的Hela為例，從樣品制備的角度出發(fā)，討論影響PI染色檢測(cè)凋亡的因素。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞Hela引自美國(guó)典型物種保藏中心，去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，胰蛋白酶（trypsin）、乙二胺四乙酸（EDTA）二鈉、PI和 Triton X－100和臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。RNase A購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所（上海）。1640培養(yǎng)液購(gòu)自GBICO公司（美國(guó)），小牛血清購(gòu)自浙江黃巖四季青生物技術(shù)公司。

1.2 試劑配制

1.2.1 Trypsin－EDTA 消化液 分別用pH7.4的0.01mol／L PBS配制5mg／ml trypsin溶液和2 mg／ml的 EDTA 溶液（用0.05mol／L NaOH 調(diào)pH為7.4），0.22μm 的濾器過率除菌后－20℃儲(chǔ)存。取兩種儲(chǔ)存液各1ml，加入無(wú)菌的8ml PBS配制為含0.5mg／ml trypsin和0.2mg／ml EDTA的消化液，該消化液中胰酶含量為通用消化的1／5。

1.2.2 PI染色液 用 PBS配制儲(chǔ)存液：10mg／ml PI，2%的 Triton X－100和20×10－3mol／L 的RNase A。使用PBS稀釋儲(chǔ)存液配制PI染色液：0.05mg／ml PI，0.2%Triton X－100和20×10－6mol／L的RNase A。

1.2.3 固定液配制 用去離子水配制80%的甲醇溶液，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃和飽和濕度條件下培養(yǎng)Hela細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)細(xì)胞密度為5×104／ml，藥物處理前16h接于培養(yǎng)瓶（底面積25cm2），每瓶液體量為10ml，細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)。取PBS配制NCTD儲(chǔ)存液（20mmol／L），分別按終濃度為0，5，10和20μmol／L加入培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 樣品制備

按照如下步驟收集細(xì)胞。①將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50ml離心管。②5ml PBS沖洗培養(yǎng)瓶2次，液體轉(zhuǎn)入相同的50ml離心管。③加入1ml trypsin－EDTA消化液（室溫或37℃），搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其均勻分布。④倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞邊緣開始卷縮，立即吸取適量離心管液體，加入培養(yǎng)瓶來(lái)終止消化，彎頭吸管輕柔吹打后將液體轉(zhuǎn)到離心管。⑤離心收集細(xì)胞，并用10ml PBS洗滌細(xì)胞1次。⑥適當(dāng)體積PBS重懸細(xì)胞，取50μl細(xì)胞懸液，加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4%），染色2min后以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞活力（活細(xì)胞白分率）。⑦取1×106個(gè)細(xì)胞，通過離心棄去PBS，邊震搖邊加入5ml 80%冷甲醇溶液固定細(xì)胞，－20℃保存，16h后可用進(jìn)行染色分析，保存時(shí)間為2～4周。⑧離心棄去固定液，5ml PBS洗滌細(xì)胞2次。⑨末次離心棄去PBS后（殘液量約為100μl），邊震搖邊加入500μl PI染色液，室溫、避光處理30min。⑩300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用CXP 2.1軟件分析細(xì)胞周期和凋亡：前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）散點(diǎn)圖中設(shè)A門（圖1A）；AUX（顆粒相對(duì)面積）和FL3（PI熒光）散點(diǎn)圖中設(shè)多邊型門B（圖1B）；FL1（PI）直方圖中分析細(xì)胞周期和凋亡，與對(duì)照組比較20μmol／L NCTD導(dǎo)致Hela細(xì)胞G2／M期比例增加，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖1C和圖1D）。Hela細(xì)胞凋亡和G2／M期細(xì)胞百分率均隨NCTD濃度增加而增加（表1）。

3 討論

圖1 PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析Hela細(xì)胞凋亡

表1 NCTD對(duì)Hela細(xì)胞凋亡和周期的影響

細(xì)胞凋亡是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，針對(duì)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生化化學(xué)改變已建立多種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。凋亡細(xì)胞PS翻轉(zhuǎn)，活細(xì)胞和早期凋亡時(shí)細(xì)胞膜通透性未改變，晚期凋亡和壞死時(shí)細(xì)胞通透性增加；AnnecxinⅤ－FITC可結(jié)合PS，PI不能進(jìn)入活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞。PI／AnnecxinⅤ 雙染法利用上述原理，可精確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞，但試劑成本高，不適合新藥篩選等工作。除血液來(lái)源腫瘤為懸浮生長(zhǎng)，更多的實(shí)體腫瘤為貼壁生長(zhǎng)。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或?qū)嶓w瘤在分析前需經(jīng)消化、刮取或剪切處理過程，膜表面的PS等分子可部分脫落，從而影響凋亡分析［3］。處理過程也可能導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，改變?cè)缙诘蛲觥⑼砥诘蛲龊蛪乃兰?xì)胞的比例，但PI染色法不受影響上述因素影響。目前，部分流式細(xì)胞儀配備了自動(dòng)上樣裝置，PI單染法可做為藥學(xué)研究的高通量篩選方法。

本研究以Hela細(xì)胞，對(duì)樣品制備和PI染色關(guān)鍵環(huán)節(jié)加以優(yōu)化，主要包括如下幾方面。①選用低濃度PI來(lái)降低染色液的黏度，防止待檢過程中細(xì)胞間的黏附和沉降。②根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)，合理設(shè)定接種細(xì)胞的密度，過高的密度下細(xì)胞間“接觸抑制”影響周期，或因營(yíng)養(yǎng)因子缺乏而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死［4］。③避免殘留培養(yǎng)液對(duì)消化液的滅活，溫和、快速消化收集細(xì)胞。④收集培養(yǎng)上清中非貼壁的細(xì)胞，避免丟失處于分裂期或部分凋亡、壞死的細(xì)胞。⑤精確控制標(biāo)本中細(xì)胞數(shù)目，使樣本間PI分子與DNA結(jié)合效率一致。⑥綜合分析凋亡率和細(xì)胞活力，判斷藥物對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)。改進(jìn)方法清晰、穩(wěn)定地檢測(cè)到NCTD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與雙染法分析結(jié)果具有一致的趨勢(shì)［5］。本研究從制備樣品的角度出發(fā)，優(yōu)化了PI單染檢測(cè)凋亡的方法。

［1］陳朱波，曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)：原理、操作及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2010.

［2］Li Y，Wang R，Ma E，et al.The induction of G2／M cell－cycle arrest and apoptosis by cucurbitacin E is associated with increased phosphorylation of eIF2alpha in leukemia cells［J］.Anticancer Drugs.2010，21（4）：389.

［3］賈永蕊.曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［4］Meshram M，Naderi S，McConkey B，et al.Population－based modeling of the progression of apoptosis in mammalian cellculture［J］.Biotechnol Bioeng，2010，109（5）：1193.

［5］An WW，Gong XF，Wang MW，et al.Norcantharidin induces apoptosis in HeLa cells through caspase，MAPK，and mitochondrial pathways［J］.Acta Pharmacol Sin，2004 ，25（11）：1502.