王紅月，顧春梅，趙 穎，崔明姬

（吉林大學第一醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130021）

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進展至終末期腎衰的共同病變過程，研究如何減緩其進展對保護腎功能具有重大的臨床意義。5／6腎切除大鼠模型造模是研究腎小管間質(zhì)損害的理想模型［1］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為一種血管活性物質(zhì)可引起腎臟血流動力學異常，但近年來人們更加關(guān)注它引起的腎臟疾病進展的非血流動力學機制，目前認為AngⅡ是一種促生長因子，在腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化過程中起十分重要的作用。本研究主要探討血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑洛汀新是否能改善5／6腎切除動物的腎臟損害，以及這種改善作用是否與抑制TGF－β1蛋白表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取清潔wistar雄性大鼠10－12W 體重220－250g（236±24g）24只，由吉林大學實驗動物中心提供，普通飼料喂養(yǎng)，室溫20－24℃。大鼠隨機分為4組：即空白對照組（Ctrl）：6只，假手術(shù)組（Sham）：6只，5／6腎切除組（Model）：6只，洛汀新治療組（Loten）：6只。

1.2 動物模型的建立 采用2%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，選取背左側(cè)切口，暴露左腎，剝離腎包膜，將腎的上下極各1／3切除，無菌線結(jié)扎止血。第一次手術(shù)后7天，行第二次手術(shù)，右側(cè)背部切開暴露右腎，結(jié)扎腎蒂，摘除右腎。假手術(shù)組與5／6腎切除組動物同期進行二次手術(shù)，但僅剝離腎包膜暴露腎臟后關(guān)腹。

1.3 治療途徑 Loten組洛汀新按0.6mg／100g／day的劑量與20ml水混合以水溶飲飼方法給藥，其余3組予以等量水于同樣的時間飲飼，從第二次術(shù)后第一天開始給予，連續(xù)5周。

1.4 動物的處死及標本的采集 于第二次手術(shù)后第5周處死動物，處死前1天將大鼠置于代謝籠中（禁食，不禁水），收集24h尿液測尿量。處死時從下腔靜脈取血置于非抗凝試管備各項檢查；取左腎組織，一部分放于液氮中保存?zhèn)溆?，另一部分組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋。

1.5 標本的處理以及生化、病理指標的檢測

1.5.1 血、尿生化指標的測定 全自動生化儀（Ol ympus AU5400）檢測24h尿蛋白定量、血漿白蛋白、血清肌酐及尿素氮。

1.5.2 腎組織病理標本制備及評價方法 腎組織經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定、包埋，切成3μm厚石蠟切片，做蘇木素－伊紅（HE）染色，對小管間質(zhì)損傷程度進行評分。腎小管間質(zhì)損傷程度評分：每份標本在100倍光鏡下隨機檢查10個不重復腎小管間質(zhì)區(qū)，按腎小管萎縮、間質(zhì)炎細胞浸潤和纖維化的范圍，分別按下述4級半定量評分進行評分，3項評分的累加得分即為腎小管間質(zhì)損傷程度。1分：無腎小管間質(zhì)損傷；2分：腎小管間質(zhì)損傷范圍＜25%；3分：腎小管間質(zhì)損傷范圍25%－49%；4分：腎小管間質(zhì)損傷范圍＞50%。

1.5.3 腎組織標本免疫組織化學染色及評分標準標本用中性福爾馬林固定，自動脫水，浸蠟，包埋，切片；再系列脫蠟脫水；3%H2O2孵育25min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3；正常羊血清封閉；滴加TGF－β1兔抗人多克隆抗體（1∶50稀釋濃縮型抗體），室溫1h，PBS 5min×3；再滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃30min，PBS洗5min×3；然后滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，37℃30min，PBS洗5min×3；DAB顯色；用蒸餾水終止反應；蘇木素復染核；酒精逐級脫水，樹膠封片。用顯微鏡下觀察腎組織中TGF－β1表達情況，照相。免疫組化半定量評分：按染色區(qū)大小和染色強度分為：0分：無染色或染色極弱；1分：局部弱染色，染色區(qū)＜25%；2分：局部染色趨強，染色區(qū)25%－49%；3分：染色增強，染色區(qū)50%－75%；4分：強染色，染色區(qū)＞75%。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)資料用±s表示，采用SPSS 13.5統(tǒng)計軟件處理。組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標檢測 Ctrl及Sham組指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），說明假手術(shù)對實驗結(jié)果無影響。Model組BUN、CRE及24小時UPE較Ctrl組升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Loten組與 Model組比較，BUN、CRE低于 Model組（P＜0.0 5）；24小時UPE降低明顯（P＜0.0 1）。Model組血白蛋白較Ctrl組降低，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Loten組與Model組比較升高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 洛汀新對5／6腎切除大鼠ALB，BUN，CRE and UPE的影響

2.2 腎組織病理學檢查 腎組織HE染色見圖1（A）。Ctrl及 Sham組：腎小管及間質(zhì)基本正常；Model組：腎間質(zhì)增寬，呈大灶狀損害，間質(zhì)炎細胞浸潤，纖維組織沉積部分腎小管萎縮、消失。Loten組：較Model組的病變減輕，可見灶狀間質(zhì)炎細胞浸潤和纖維化，腎小管萎縮。腎小管間質(zhì)損傷評分見圖1（B），Model組評分較Ctrl組明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Loten組與 Model組比較降低，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 免疫組化分析腎小管間質(zhì)TGF－β1的表達TGF－β1的免疫組化染色見圖2（A），TGF－β1陽性表達主要見于病變區(qū)腎小管上皮細胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)。免疫組化半定量評分見圖2（B），Model組表達最強，Loten組減弱。

圖1 （A）各組大鼠組織形態(tài)學變化（HE染色X200）；（B）各組大鼠腎間質(zhì)損傷評分

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是導致終末期腎衰的病理學基礎(chǔ)，其機制認為是由于纖維化有關(guān)的細胞因子，尤其是TGF－β1參與炎性損傷而導致成纖維細胞增值的結(jié)果。慢性間質(zhì)性腎炎的動物模型為研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機制及其干預措施能夠提供有效的手段。5／6腎切除動物模型造模方法比較簡便，5／6腎切除后，有效腎單位減少，形成剩余腎小球高灌注、高灌注及高壓力，最終導致慢性腎衰竭，比較符合人類慢性間質(zhì)性腎炎的腎小管間質(zhì)損害的病理改變過程。有研究證實5／6腎切除后第1周已出現(xiàn)血尿素氮及肌酐升高，16周內(nèi)穩(wěn)定于氮質(zhì)血癥期，且腎切后尿蛋白升高［1，2］，因此是研究腎小管間質(zhì)損害導致慢性腎衰竭的理想動物模型。

腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是機體進化過程中高度保守的網(wǎng)絡，AngII在各種腎臟疾病的慢性化過程中發(fā)揮重要的作用，是公認的致腎損害的因子。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對腎臟有確切保護作用［3，4］，且已廣泛用于臨床，關(guān)于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的腎臟保護作用的機制一直是近年來研究的熱點。有研究提示，AngII可能涉及細胞外基質(zhì)在腎臟的沉積，輸注AngII可導致間質(zhì)纖維化，而應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可減少膠原的沉積［5］。Wolf等［6］研究發(fā)現(xiàn)，AngII可刺激腎小管上皮細胞產(chǎn)生TGF－β1。ACEI可降低大鼠梗阻性腎病模型的TGF－β1和Ⅳ型膠原 mRNA水平［7］。但 ACEI類藥物洛汀新是否對5／6腎切除大鼠的腎臟損害有保護作用以及是否與降低TGF－β1的蛋白表達有關(guān)，目前這方面的研究很少，我們的實驗主要探討這一問題。

圖2 （A）各組大鼠TGF－β1表達（免疫組化X200）；（B）免疫組化半定量分析

我們的實驗結(jié)果顯示，從生化及腎組織病理學方面，Ctrl組和Sham組無統(tǒng)計學差異，表明假手術(shù)對實驗結(jié)果無影響。Loten組和Model組，術(shù)后第5周與Ctrl組比較，血尿素氮和肌酐升高，24小時尿蛋白增加，血漿白蛋白下降，其中Loten組與Model組比較變化相對較小，說明5／6腎切除大鼠第5周可出現(xiàn)慢性腎功能不全，與既往報導一致［3］。腎臟病理光鏡HE染色顯示，Ctrl組和Sham組腎小管及間質(zhì)基本正常，Loten組和Model組腎間質(zhì)大灶狀損害，間質(zhì)可見炎細胞浸潤，纖維組織沉積，部分腎小管萎縮、消失，其中Loten組與Model組比較病變相對較輕，說明5／6腎切除大鼠第5周腎間質(zhì)纖維化明顯，且RSA系統(tǒng)可能參與腎小管間質(zhì)纖維化的病變過程。

TGF－β1作為介導腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子，刺激腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。我們的研究結(jié)果顯示，5／6腎切除大鼠第5周TGF－β1蛋白表達明顯上升，且TGF－β1陽性表達主要見于病變區(qū)腎小管上皮細胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)，免疫組化半定量評分結(jié)果顯示，Model組表達最強，Loten組與 Model組比較相對減弱，由此我們認為5／6腎切除后大鼠TGF－β1的過度表達參與了腎間質(zhì)纖維化的病變過程，最終至慢性腎衰竭，血管緊張轉(zhuǎn)換酶抑制劑洛汀新有減少TGF－β1表達的作用，與生化及腎組織病理學變化相吻合。提示血管緊張轉(zhuǎn)換酶抑制劑可能阻斷RSA系統(tǒng)的激活，減少腎臟成纖維細胞中TGF－β1的生成，保護腎功能。本研究認為TGF－β1與5／6腎切除大鼠腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系提供了新的實驗依據(jù)，闡明了洛汀新在治療腎間質(zhì)纖維化的意義。相信隨著研究的深入，血管緊張轉(zhuǎn)換酶抑制劑在腎臟疾病治療中的作用機制將會進一步明確，為臨床提供新的思路和方法。

［1］SHEN Yanchun，et al.Renal Pathological Changes in Rats with 5／6Nephrectomy［J］.Shanghai Laboratory Animal Science，2005，25（1）：21.

［2］Barata K，Yoshida M，Hokao R，et al.Function in 5／6nephrectomized rats－basic study for renal toxicity using 5／6nephrectomized rats［J］.J Toxicol Sci，1998，23（5）：433.

［3］Ihle BU，Whitworth JA，Shahinfar S，Cnaan A，et al.Angiotensinconverting enzyme inhibition in nondiabetic progressive renal insufficiency：a controlled double－blind trial［J］.Am J Kidney Dis，1996，27：489.

［4］Hou FF，Zhang X，Zhang GH，et al.Efficacy and safety of benazepril for advanced chronic renal insufficiency［J］.N Engl J Med，2006，354：131.

［5］Wolf G.Angiotensin II is involved in the progression of renal disease：importance of non－h(huán)emodynamic mechanisms［J］.Nephrologie，1998，19：451.

［6］Wolf G，Mueller E，Stahl RAK，et al.Angiotensin II induced hypertrophy of cultured murine proximal tubular cells is mediated by endogenous transforming growth factor－β1［J］.J Clin Invest，1993，92：1366.

［7］Pimentel Jr，Sundell CI，Wang S，et al.Role of angiotensin II in the expression and regulation of transforming growth factor－β1in obstructive nephropathy［J］.Kidney Int，1995，48：1233.