邱志東，范琳峰，雷長江，繆輝來

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣東 湛江524001）

胰腺癌是一種惡性程度高，進(jìn)展迅速，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差的惡性腫瘤，本文從表觀遺傳學(xué)的角度研究Runx3基因在胰腺癌細(xì)胞中失表達(dá)的機(jī)制，以期為胰腺癌的早期診斷及新的治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）細(xì)胞株：Panc－1、BxPC－3、AsPC－1三種胰腺癌細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）；（2）主要試劑：DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），TRIZOL總RNA提取試劑盒、PrimeScript OneStep RT－PCR Kit Ver.2（大連寶生物公司）、One step sybr primescripttmrtpcr kitⅡ（大連寶生物公司），EZ DNA甲基化試劑盒－direct、Zymo Taqtm PreMix（美國 ZYMO RESEARCH公司），引物、內(nèi)參（上海生物工程公司、大連寶生物公司），Western封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、一抗二抗去除液、鼠抗人GADPH抗體（碧云天生物技術(shù)研究所），小鼠抗人Runx3單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）。

1.2 方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。（2）RT－PCR檢測 Runx3基因的表達(dá)：①癌細(xì)胞株及胰腺組織中RNA的抽提；②引物序列及產(chǎn)物長度：Runx3上游引物為5′－AGGCATTGCGCAGCTCAGCGGAGT－3′，Runx3 下游 引 物 為 5′－AGGCATTGCGCAGCTCAGCGGAGTA－3′，擴(kuò)增長度為152bp，β－actin上游引物為 5′－TGGCACCCAGCACAATGAA－3′，β－actin下游引物 為 5′－CT AAGTCATAG TCCGCCTAGAAGCA－3′，擴(kuò)增長度為186bp，引物均由上海生工合成，引物離心后用0.1%DEPC處理水稀釋至所需濃度，－20℃保存；③參照TaKaRa公司的onestep RT－PCR Kit使用說明書進(jìn)行RT－PCR；④瓊脂糖凝膠電泳和圖象分析。（3）Westren blotting：①樣品制備；②蛋白定量；③SDS－PAGE電泳；④轉(zhuǎn)膜；⑤封閉及抗原抗體反應(yīng)；⑥化學(xué)發(fā)光顯影、定影及圖像分析。（4）甲基化特異PCR：①細(xì)胞計(jì)數(shù)；②貼壁細(xì)胞DNA提?。虎壅Ｒ认俳M織中提取DNA；④引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增長度，Runx3基因的甲基化特異性PCR引物用Methprimer軟件設(shè)計(jì)，甲基化引 物 （M）上 游 為：5′－CGTCGGGTTAGCGAGGTTTC－3′，下游為：5′－GCCGCTACCG CGAAAAACGA－3′，擴(kuò)增長度120bp；非甲基化引物（U）上游為：5′– GTGGGTGG TTGTTGGGTTAGT－3′，下游 引 物 為：5′－TCCTCAACCACCACTA CCACA－3′，擴(kuò)增長度為138bp，引物均由上海生工合成。⑤甲基化特異性PCR；⑦瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Runx3基因mRNA表達(dá) RT－PCR檢測結(jié)果顯示在Panc－1、BxPC－3、AsPC－1 3種胰腺癌細(xì)胞株中Runx3基因的mRNA電泳未見亮條帶，而在正常胰腺組織中Runx3基因的mRNA電泳有亮條帶出現(xiàn)（見圖2.1）；用Quantity One軟件測量條帶灰度值，以目的基因與β－actin內(nèi)參條帶的光密度積分值之比進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示正常胰腺組織的值為1.3594±0.0059，而Panc－1、BxPC－3、AsPC－1未測得相對(duì)定量值，說明在正常胰腺組織中Runx3基因的mRNA有表達(dá)，而在3種胰腺癌細(xì)胞株中沒有表達(dá)。

圖2.1 RT－PCR凝膠電泳

2.2 Runx3基因蛋白表達(dá) Western blotting法未能檢測到 Panc－1、BxPC－3、AsPC－1的 Runx3蛋白表達(dá)（圖2.2）

2.3 Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化 利用MSP檢測法顯示在 Panc－1、BxPC－3、AsPC－1胰腺癌細(xì)胞株中，Runx3基因甲基化引物均擴(kuò)增出產(chǎn)物，電泳可見120bp處有亮條帶，非甲基化引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物；而在正常胰腺組織中Runx3基因非甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物，而甲基化引物則未擴(kuò)增出引物。

圖2.2 Panc－1、BxPC－3、AsPC－1細(xì)胞 Runx3蛋白表達(dá)水平

圖2.3 正常胰腺組織與各癌細(xì)胞株Runx3基因的甲基化情況

3 討論

胰腺癌的發(fā)生與很多因素有關(guān)，包括基因水平上的改變和后生修飾的累積效應(yīng)，如癌基因的激活或抑癌基因的失活。DNA甲基化在基因沉默、基因組印記、X染色體失活和腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。近期研究提示許多抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是腫瘤發(fā)生過程中基因失活的重要原因，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機(jī)制［1，2］。最近的研究表明Runx3可能是一新的抑瘤基因，其在宮頸癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膽管癌、胰癌和肺癌等多種腫瘤中有不同程度表達(dá)缺失或者下調(diào)［3－8］。Wada等用 Northern blotting和 RT－PCR研究顯示75%的胰腺癌細(xì)胞株Runx3mRNA及蛋白沒有發(fā)生表達(dá)（9／12）［9］，但是其原因未明。本研究也未能檢測到 Panc－1、BxPC－3、AsPC－1中 Runx3基因mRNA及蛋白表達(dá)，而正常胰腺組織可檢測到Runx3基因mRNA表達(dá)；同時(shí)我們通過MSP方法檢測了正常胰腺組織和人胰腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)Panc－1、BxPC－3、AsPC－1癌細(xì)胞中均檢測到Runx3基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化，而正常胰腺組織中Runx3基因啟動(dòng)子CpG島沒有出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，由此我們大膽推測，Runx3基因在胰腺癌細(xì)胞中的失表達(dá)可能與Runx3基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化有關(guān)。

眾所周知，胰腺癌惡性程度高，易轉(zhuǎn)移且預(yù)后較差，手術(shù)切除是治療胰腺癌的主要手段，但很多胰腺癌患者在確診后就喪失了根治性切除的機(jī)會(huì)，而作為晚期胰腺癌的一線化療藥物吉西他濱，接受其單藥治療患者的中位生存期僅為6個(gè)月左右，并且吉西他濱與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用并不能延長患者的生存期［10］。改變基因表觀遺傳學(xué)是目前一種新的臨床治療癌癥的方法，本研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因在胰腺癌細(xì)胞中的失表達(dá)可能與Runx3基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化有關(guān)，那么如果能夠使Runx3基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生去甲基化，是否就能使Runx3基因重新表達(dá)，從而起到治療腫瘤的作用？這是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

［1］Jones PA，Takai D.The role of DNA methylation in mammalion epigenetics［J］.Science，2001，293（5532）：1068.

［2］Ehrlich M.DNA methylation in cancer：too much，but also too little［J］.Oncogene，2002，21（35）：5400.

［3］Kang S，kim JW，Kang GH，et al.Polymorphism in folate－and methionine－metabolizing enzyme and aberrant CPG island hypermethylation in uterine cervical cancer［J］.Gynecologic Oncology，2005，96（1）：173.

［4］肖文華，劉為紋.肝細(xì)胞癌RUNX3基因甲基化與雜合缺失的分析及意義［J］.中華肝臟病雜志，2004，12（4）：227.

［5］Takahashi T，Shivapurkar N，Riquelme E，et al.Aberrant promoter hypermeth－ylation of multiple genes in gallbladder carcinoma and chronic cholecystitis［J］.Clin Cancer Res，2004，10：6126.

［6］Sakakijra C，Hagiwara A，Miyagawa K，et al.Frequent downregulation of the runt domain transcription factors RUNX1，RUNX3 and their cofactor CBFB in gastric cancer［J］.International Journal of Cancer，2005，113（2）：221.

［7］Nomoto S，Kinoshita T.Mori T，et al.Adverse prognosis of epigenetic inactiv－ation in RUNX3gene at 1p36in human pancreatic cancer［J］.British Journal of Cancer，2008，98（10）：1690.

［8］Peng Z，Tang H，Wang X，et al.Inhibition of the growth and metastasis of human colon cancer by restoration of RUNX3expression in cancer cells［J］.International journal of oncology，2008，33（5）：979.

［9］Wada M，Yazumi S，Takaishi S，et al.Frequent loss of Runx3 gene expression in human bile duct and pancreatic cancer cell lines［J］.Oncogene，2004，23（13）：2401.

［10］Louvet C，Labianca R，Hammel P，et al.Gemcitabine in combination with oxaliplatin compared with gemcitabine alone in locally advanced or metastatic pancreatic cancer：results of a GERCOR an d GISCAD phaseⅢtrial［J］.J Clin Oncol，2005，23（15）：3509.