張麗娜，張淑敏

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 天津市泌尿外科研究所，天津300211）

波形蛋白（vimentin）屬于Ⅲ型中間絲蛋白，表達在間充質(zhì)細胞和一些外胚層細胞［1］，多種上皮性腫瘤細胞表達波形蛋白，且被認為與腫瘤細胞的惡性程度密切相關(guān)［2，3］。Ki－67是細胞核內(nèi)與細胞分裂及增殖相關(guān)的核蛋白，其表達與細胞增殖狀態(tài)高度相關(guān)，是反映腫瘤細胞增殖活性和判斷腫瘤惡性程度的指標(biāo)［4］。CD34主要分布于血管內(nèi)皮細胞，可作為內(nèi)皮細胞的特異標(biāo)志計算腫瘤微血管密度，了解腫瘤的血管形成情況。我們采用免疫組織化學(xué)SP法對68例透明細胞性腎細胞癌組織中vimentin、Ki－67和CD34的表達情況進行研究，并探討其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 天津市泌尿外科研究所病理科2010年1月至2011年2月收檢的腎根治術(shù)后標(biāo)本68例，男52例，女16例；年齡27－70歲，平均年齡52.3歲；左側(cè)38例，右側(cè)30例；腫瘤直徑0.4cm－13cm，平均4.7cm。病理分期采用2004年 WHO腎細胞癌分期系統(tǒng)：pT1：36例；pT2：26例；pT3：4例；pT4：2例；組織學(xué)分級用1982年Fuhrman四級分類法：Ⅰ級：12例；Ⅱ級：39例；Ⅲ級：14例；Ⅳ：3例。所有患者術(shù)前均未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移并無其他惡性腫瘤病史，術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。全部68例為實驗組，病理證實均為透明細胞性腎細胞癌，另取距腫瘤邊緣2cm癌旁組織40例作為對照組，經(jīng)病理證實均為正常腎臟組織。

1.2 試劑 鏈親和素－生物素－過氧化物酶（Streptavidin－biotin immunoperoxidase，SP）試劑盒及vimentin單克隆抗體（ZM－0260）、Ki－67單克隆抗體（ZM－0166）和CD34單克隆抗體（ZM－0046）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 vimentin、Ki－67和CD34表達檢測均采用SP法，試驗步驟按照說明書進行。以正常腎組織中的腎小球作為vimentin和CD34的陽性對照，以乳腺癌組織作為CD34的陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 vimentin染色程度判斷 陽性結(jié)果為比較鮮明的棕黃色染色，靠近包膜或充滿包漿，彌散分布。按文獻進行染色程度判斷［5］每張切片隨機選取10個高倍視野，每個高倍視野計數(shù)100個癌細胞，觀察陽性細胞染色強度，計數(shù)陽性細胞百分數(shù)并進行評分：1分為陽性細胞百分率≤10%；2分為陽性細胞占11%－40%；3分為陽性細胞占41%－70%；4分為陽性細胞百分率≥70%。根據(jù)染色強度計算分數(shù)：0分無染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色顆粒。結(jié)果取兩者評分之乘積，0分為陰性（－），1－2分為弱陽性（＋），3－4分為陽性（＋＋），大于4分為強陽性（＋＋＋）。

1.4.2 Ki－67染色程度判斷 Ki－67以胞核呈棕黃色為陽性。按文獻 Ki－67計數(shù)標(biāo)準［6］，每張切片隨機數(shù)5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計數(shù)1000個細胞，計算每張切片陽性細胞百分率，無陽性細胞為陰性（－），陽性細胞數(shù)＜10%為弱陽性（＋），10%－30%為陽性（＋＋），＞30%為強陽性（＋＋＋）。

1.4.3 CD34的表達和 MVD計數(shù) CD34陽性染色呈棕黃色，分布在細胞質(zhì)及細胞膜上。采用Weidner微血管計量方法。即每一個染成棕黃色的，可與周圍血管、腫瘤細胞和其他結(jié)締組織區(qū)分開的內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮細胞簇，不論管腔和紅細胞出現(xiàn)與否，均作為一個單一的、可計數(shù)的微血管。每張切片先在10倍物鏡下尋找腫瘤中微血管密度最高的3個區(qū)域，然后在40倍物鏡下計數(shù)5個視野的微血管，取其平均值。本過程按盲法操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

透明細胞性腎細胞癌組織中vimentin蛋白的表達（見表1）。正常腎組織中小管上皮細胞陽性表達率為10.00%；CCRCC組織中陽性表達率為76.47%，兩組有顯著性差異（P＜0.01）。正常腎組織的表達均為弱陽性，CCRCC中強陽性17例，陽性30例，弱陽性5例。CCRCC不同病理分期中pT1與pT2及pT1與pT3＋pT4之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組織學(xué)分級三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

透明細胞性腎細胞癌組織中ki－67蛋白的表達（見表1）。正常腎組織中小管上皮細胞核陽性表達率為0；CCRCC組織中陽性表達率為89.71%，兩組有顯著性差異（P＜0.01）。CCRCC中強陽性14例，陽性42例，弱陽性5例。不同病理分期三組之間無顯著性差異（P＞0.05）。組織學(xué)分級表現(xiàn)為Ⅰ級與Ⅱ級及Ⅰ級與Ⅲ級＋Ⅳ級之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

透明細胞性腎細胞癌組織中MVD計數(shù)（見表1）。CCRCC組織中MVD計數(shù)高于正常腎組織，兩組有顯著性差異（P＜0.01）。pT1與pT3＋ T4及pT2與pT3＋ T4之間有顯著性差異（P＜0.05）；pT1與pT2之間無顯著性差異（P＞0.05）。組織學(xué)分級三者之間具有顯著性差異（P＜0.05）。

vimentin、Ki－67和 MVD計數(shù)間的關(guān)系：統(tǒng)計分析表明，CCRCC組織中vimentin表達與 MVD計數(shù)呈正相關(guān)（r＝0.928，P＜0.01）；Ki－67表達與MVD計數(shù)亦呈正相關(guān)（r＝0.895，P＜0.01）。

VEGF與 Ki－67表達無顯著性差異（P＞0.05），顯示二者的陽性表達趨于一致。

3 討論

vimentin是一種Ⅲ型中間絲蛋白，主要在間葉組織中表達，可作為在組織病理學(xué)診斷中鑒別腫瘤細胞分化起源的特異性標(biāo)記物［7］。Vimentin在乳腺癌、肝細胞癌、透明細胞性腎細胞癌等多種上皮癌中表達［8－10］，其高表達與癌細胞的分化程度低、侵襲性強和易轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［11］。本研究發(fā)現(xiàn)CCRCC組織中vimentin的陽性表達率顯著高于正常腎臟組織，且癌的病理分期及核分級越高，其表達強度和陽性表達率越高，提示vimentin表達增加可能在腎細胞癌的發(fā)生及進展中起重要作用。

表1 CRCC和正常腎組織中vimentin、ki－67的表達及MVD計數(shù)

Ki－67是目前應(yīng)用最廣的細胞增殖標(biāo)志之一，能可靠地反映腫瘤細胞增殖情況。本研究顯示Ki－67在CCRCC組織中的陽性表達率為89.71%，且癌的病理分期及核分級越高，其表達強度和陽性表達率越高，而正常腎臟組織不表達，提示Ki－67標(biāo)記有利于判斷CCRCC的分化程度，為評估其預(yù)后提供參考。

血管生成是腫瘤侵襲性生長和轉(zhuǎn)移的必備條件之一，新生血管不僅為腫瘤細胞的增殖提供養(yǎng)分，而且是腫瘤細胞進一步侵襲的重要途徑。由于MVD能反映腫瘤血管的發(fā)生情況，Ueda等認為MVD計數(shù)可作為判斷癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的可靠指標(biāo)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，CCRCC組織中vimentin和Ki－67表達都與MVD計數(shù)呈正相關(guān)；vimentin和Ki－67的陽性表達率具有相似性，提示vimentin和 Ki－67在CCRCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起協(xié)同作用。另外，vimentin既在癌細胞中表達，同時也在間質(zhì)中表達這一特征提示，其有促使新生血管形成的可能。腫瘤細胞生長與血管生成是相互依賴和相互促進的關(guān)系，聯(lián)合檢測vimentin、Ki－67和 CD34在 CCRCC組織中的表達，有助于判斷其生物學(xué)行為和預(yù)后，從而更好的指導(dǎo)該病的治療。

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