劉青松，張科偉，薛夢(mèng)華，李 智，劉 偉＊

（1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 胸外科，陜西 西安710038）

α微管蛋白（α－tubulin）是細(xì)胞骨架的組成成分之一，在細(xì)胞有絲分裂和染色體分離中起關(guān)鍵作用［1］。有研究表明通過(guò)藥物作用微管蛋白能夠阻止腫瘤細(xì)胞的有絲分裂導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡期，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［2］，因此微管蛋白在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。肺癌，特別是NSCLC是全世界癌癥死亡的主要原因之一，我國(guó)肺癌的發(fā)病率也在不斷攀升［3］，目前關(guān)于NSCLC與微管蛋白的研究主要集中在βⅢ－tubulin［4－6］，而關(guān)于α－tubulin的研究甚少。本研究通過(guò)組織芯片技術(shù)采用免疫組化方法檢測(cè)α－tubulin在NSCLC石蠟標(biāo)本中表達(dá)狀況，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組91例NSCLC石蠟組織切片取自1998年1月－2003年12月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療且隨訪資料完整的患者，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理明確診斷，術(shù)前均未接受化療、放療和其他治療。91例患者中男性67例，女性24例；年齡35－77歲，中位年齡61歲；非吸煙者36例，吸煙者55例；根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期42例，Ⅱ期25例，Ⅲ期24例；病理類型中鱗癌53例，腺癌38例；隨訪截止日期為2008年4月8日，中位生存期為52±14個(gè)月。

1.2 組織芯片制備

91例NSCLC石蠟組織HE染色切片復(fù)檢后標(biāo)記供體蠟塊靶點(diǎn)；利用組織芯片制作儀（Beecher Instruments公司），從供體蠟塊上穿取直徑為1mm組織芯2條，依次插入有200個(gè)點(diǎn)陣的受體蠟塊中制作組織芯片蠟塊；以5μm厚度連續(xù)切片，陣列切片置于60℃恒溫烤箱中烤片16h；組織芯片進(jìn)行HE染色復(fù)檢合格后置于5℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 試劑 本實(shí)驗(yàn)采用兔抗人多克隆α－tubulin抗體，購(gòu)自Cell Signaling公司，適用于石蠟切片，二抗采用抗兔免疫組化檢測(cè)試劑盒（EnVision＋／HRP／Rb），DAKO抗體稀釋液，顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購(gòu)自DAKO公司。

1.3.2 結(jié)果判定 α－tubulin主要在細(xì)胞胞漿內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)，α－tubulin陽(yáng)性表達(dá)根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色百分率與胞漿染色強(qiáng)弱（陰性＝0，弱陽(yáng)性＝1，中陽(yáng)性＝2，強(qiáng)陽(yáng)性＝3）的乘積計(jì)算。兩者乘積≥200者為陽(yáng)性高表達(dá)，＜200者為陽(yáng)性低表達(dá)。（見(jiàn)圖1、圖2）

圖1 NSCLC鱗癌組織α－tubulin高表達(dá)（20×10倍數(shù)）

圖2 NSCLC腺癌組織α－tubulin低表達(dá)（20×10倍數(shù)）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，α－tubulin高表達(dá)者與患者年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、腫瘤分期等臨床病理資料的關(guān)系用Pearsonχ2檢驗(yàn)或Fisher＇s精確概率法檢驗(yàn)，生存率計(jì)算采用壽命表法并繪制Kaplan－Meier估計(jì)生存曲線進(jìn)行單因素分析，經(jīng)Log－rank檢驗(yàn)后P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α－tubulin在91例NSCLC樣本腫瘤細(xì)胞的胞漿中均存在表達(dá)，其中高表達(dá)者38.46%（35／91），低表達(dá)者61.54%（56／91）。≤55歲患者中α－tubulin高表達(dá)者顯著高于＞55歲患者（χ2＝6.267，P＝0.012），Ⅰ期和Ⅱ期高表達(dá)者顯著高于Ⅲ期患者（χ2＝4.280，P＝0.039），鱗癌中高表達(dá)者顯著高于腺癌（χ2＝4.067，P＝0.044）。α－tubulin表達(dá)與患者性別、吸煙狀況、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。（見(jiàn)表1）

2.2 生存分析表明 α－tubulin高表達(dá)組中位生存期57個(gè)月，低表達(dá)組中位生存期35個(gè)月，兩組生存期未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.082）。但在≤55歲患者中，α－tubulin高表達(dá)組中位生存期76個(gè)月，低表達(dá)組中位生存期28個(gè)月，α－tubulin高表達(dá)者預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)者（P＝0.011）（見(jiàn)圖3）。在鱗癌患者中，α－tubulin高表達(dá)組中位生存期80個(gè)月，低表達(dá)組中位生存期37個(gè)月，α－tubulin高表達(dá)者預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)者（P＝0.023）（見(jiàn)圖4）。

表1 α－tubulin在NSCLC癌細(xì)胞胞漿中表達(dá)情況

圖3 年齡≤55歲患者α－tubulin低表達(dá)和高表達(dá)的生存曲線（P＝0.011）

圖4 鱗癌患者中α－tubulin低表達(dá)和高表達(dá)的生存曲線（P＝0.023）

3 討論

微管由α、β微管蛋白異源二聚體以及微管輔助蛋白組成，在微管組織中心中組裝為單管、二聯(lián)管（纖毛和鞭毛）、三聯(lián)管（中心粒和基礎(chǔ)小體）、紡錘體、基粒、軸突、神經(jīng)管等結(jié)構(gòu)［1］，參與維持細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，有絲分裂，染色體分離等過(guò)程，尤其是微管不斷延伸和縮短的特有動(dòng)力學(xué)，在細(xì)胞有絲分裂和染色體的分離起關(guān)鍵作用［7］。當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖活躍時(shí)，有絲分裂處于活躍狀態(tài)，相應(yīng)的微管蛋白異常表達(dá)。某些藥物作用于微管蛋白使微管動(dòng)力學(xué)受到影響，腫瘤細(xì)胞無(wú)法形成紡錘體，使細(xì)胞分裂停止在G2期（DNA合成期），促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［2，8，9］，提示微管蛋白與腫瘤細(xì) 胞的增殖和凋亡有密切關(guān)系。本研究結(jié)果表明，α－tubulin在NSCLC中雖然存在非常廣泛的表達(dá)，但高表達(dá)者僅有38.46%，而且早期NSCLC患者顯著高于晚期患者，這與βⅢ－tubulin在卵巢癌中的表達(dá)截然不同，有研究表明βⅢ－tubulin高表達(dá)者卵巢癌的侵襲性更大且預(yù)后更差［10］。蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能不但與蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，也與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)，如α－tubulin和βⅢ－tubulin的轉(zhuǎn)錄后修飾機(jī)制不同，α－tubulin的轉(zhuǎn)錄后修飾與酪氨酸化、去酪氨酸化和乙?；嘘P(guān)，而β－tubulin蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾與磷酸化有關(guān)［11］，而且有研究進(jìn)一步證明參與α－tubulin酪氨酸化作用的微管蛋白酪氨酸連接酶（Tubulin Tyrosine Ligase，TTL）對(duì)動(dòng)物腫瘤和人類腫瘤起負(fù)調(diào)節(jié)作用，TTL蛋白表達(dá)降低與腫瘤的發(fā)生、侵襲和不良預(yù)后有關(guān)［12，13］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，αtubulin和β－tubulin對(duì)微管的穩(wěn)定性作用不同，αtubulin與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）或二磷酸鳥苷－Pi復(fù)合物（guanosine diphosphate－Pi，GDP－Pi）結(jié)合后，在微管的 N－端結(jié)構(gòu)區(qū)域形成“帽子”結(jié)構(gòu)，使微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；β－tubulin與GTP或GDP－Pi結(jié)合后，易被水解成GDP，引起微管解聚［14］，α－tubulin表達(dá)增高，微管穩(wěn)定延伸，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，因此可能與NSCLC中α－tubulin高表達(dá)者腫瘤侵襲性較小，預(yù)后相對(duì)較好有關(guān)。本研究還顯示α－tubulin在不同年齡（≤55歲和＞55歲）、不同病理類型（鱗癌和腺癌）患者中表達(dá)存在顯著差異，這也提示α－tubulin在不同年齡和不同病理類型的NSCLC中的作用機(jī)制也可能存在顯著差異，值得更深一步的研究。

總之，本研究初步揭示了α－tubulin在NSCLC中的表達(dá)狀況及其臨床意義，隨著針對(duì)α－tubulin在NSCLC作用機(jī)制中的更深入研究，α－tubulin有可能在NSCLC診斷、分子靶向治療以及化學(xué)治療中成為非常有意義的生物標(biāo)記物，從而更科學(xué)合理地指導(dǎo)NSCLC的臨床診療。

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