王平 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

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MicroRNA研究方法進展

王平 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

miRNAs是一類內(nèi)源性、約22個核苷酸長度的非編碼RNA，具有穩(wěn)定的特異性序列以調(diào)節(jié)基因表達。2001年，miRNAs作為線蟲生長發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)器而被發(fā)現(xiàn)，在病毒、植物和動物體中，miRNAs已被公認為主要的調(diào)控基因家族之一，通過mRNA靶向作用降解或抑制其翻譯。

小RNA在生物進化過程中高度保守，并已被證實參與和調(diào)控包括時序發(fā)育、細胞凋亡脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程，以及包括肺癌、白血病在內(nèi)的多種疾病發(fā)生過程[1]。目前，對小RNA表達的鑒定主要依靠以雜交、PCR、生物芯片的方法；對靶標的確定，主要依靠生物信息學方法；對其功能線索的獲得，則主要依賴于在特定細胞或動物模型內(nèi)外源性抑制或表達相應的小RNA基因，再通過報告基因系統(tǒng)驗證后檢測特定細胞或動物模型發(fā)育過程中的生化或分子變化來實現(xiàn)，并同時利用報告基因系統(tǒng)對小RNA的靶基因進行驗證。在此筆者對經(jīng)典的及最新發(fā)展的研究小RNA的技術方法作簡要的總結和概述。

1 miRNA基因鑒定

1.1 遺傳學方法

正向遺傳學的原理是把突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當中分離出來，進行研究鑒定。而反向遺傳學則在體外引入特定的突變，然后把已突變的基因放回到原來的宿主當中，而且常常是通過同型基因化或換位放回到宿主中原來的位置上，從而觀察表型的改變。在研究miRNAs的時候，反向遺傳學分析方法常常與生物信息學分析相結合，對可能的miRNAs基因進行預測，然后運用反向遺傳學分析方法引進突變，觀察表型，從而對基因進行定位。

1.2 分子生物學方法

1.2.1 miRNA克隆 不同的小RNA克隆方法的原理基本一致：首先，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離RNA片段，回收20-25 ntRNAs。接著，將篩選的RNA分子，連接到3’和5’的適配子上，逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴增，獲得miRNAs 的cDNA文庫，然后對這些cDNA進行克隆、測序，再結合生物信息學軟件進行分析。在進行miRNAs和適配子連接前通常要進行以下處理：miRNA去磷酸化、合成3’適配子時把3’末端羥基與非核苷酸基團連接，屏蔽羥基、或者在合成3’適配子時把3’末端在多聚腺苷酸酶的作用下增加poly(A)尾巴[2]。

1.2.2 Northern雜交 PAGE及隨后的Northern雜交，為小RNA檢測提供了簡便而可靠的方法。Northern雜交不僅具有高靈敏的特點，還能結合使用RNA marker檢測小RNA的分子大小，這對于排除其它小分子RNA的污染有重要意義。Northern雜交也可作為miRNA定量的方法，只需將已知濃度梯度的寡核苷酸對照物與待測樣品進行平行雜交即可[3]。

1.2.3 基因芯片(microarray) 對miRNAs表達水平高通量分析的最普遍的方法是使用寡核苷酸微陣列[4]，在大樣本的研究中，使用這種方法能夠同時測量成百上千miRNAs的基因表達。另外一種微陣列方法叫作微流引物延伸檢測Microfluidic Primer Extension Assay(MPEA)，這種檢測方法以Febit Geniom?微陣技術的使用為基礎，miRNA在高度靈敏的微陣列雜交前，不需要標記。接著，DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流動芯片的通道中，相應的miRNA得以特異延伸。此方法將雜交檢測的特異性與酶延伸的高辨別能力相結合[5]。

1.2.4 實時定量PCR 與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏地檢測出低豐度表達的靶分子，并適于高通量篩選。PCR擴增簡要過程如下：首先將純化的小分子量RNA與引物混合，經(jīng)變性、復性過程使引物與模板配對；然后，加入包含逆轉(zhuǎn)錄酶、底物、DTT以及RNA酶抑制劑的混合物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；再以cDNA為模板，進行實時定量PCR。

2 miRNA靶標鑒定

2.1 計算機預測

絕大多數(shù)的miRNAs都是通過堿基配對的方式結合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū)，從而抑制其翻譯，達到調(diào)控基因表達的目的。因此靶標的鑒定對研究miRNA的功能至關重要。隨著生物信息學和計算機在生物研究應用的發(fā)展，很多實驗室都建立了靶標鑒定的計算機方法，計算機預測的靶標具有可靠性、可驗證性的優(yōu)點。

到目前為止，根據(jù)不同標準已經(jīng)建立了很多計算機程序篩選法(附表)。2003年，Stark和同事通過程序?qū)诟构壢蚪M搜尋鑒定潛在的miRNA靶標首先得到成功[6]。

附表 已建立的靶標預測方法

MethodType of methodRefsMethod Availa-bilityData Avail-abilityResource http:// Stark et al.Complementarity[7]Online searchYeswww.russell.embl.de/miRNAs/ miRandaComplementarity[8]DownloadYeswww.microrna.org/ miRanda miRBaseComplementarity[9]Online searchYesmicrorna.sanger.ac.uk/ TargetScan Seedcomplementarity[10]Online searchYeswww.targetscan.org/ DIANAThermodynamics[11]Dow-nloadYesdiana.pcbi.upenn.edu/ PicTarThermodynamics[12] Yespictar.bio.nyu.edu/ RNAHy-bridThermodynamics and statistical model[13]Dow-nload bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ miTargetSVMe[14]Online Search cbit.snu.ac.kr/ miTarget/

2.2 miR-TRAP技術

miR-TRAP技術是最新發(fā)展的技術。操作miR-TRAP可分為三個基本步驟，首先通過共軛補骨脂素(一種可通過光激活的植物分子)生成針對目的miRNA的高度光反應探針，第二步完成長波紫外線光交聯(lián)反應，第三步拉下(pull down)RNA，并用RT-qPCR對其進行分析。換句話說，利用紫外線光殺死細胞，將miRNA/mRNA雙雙冷凍在適當?shù)奈恢?。隨后從細胞中抽提出RNA，可以進一步檢測結合mRNA序列，揭示miRNA的靶基因。

3 miRNA功能的研究

3.1 小RNA抑制

目前，主要有兩種方法可以阻斷小RNA的作用：一是敲除小RNA基因或其在靶基因上的結合位點，二是小RNA的序列特異性抑制。由于分子大小的限制，小RNA基因直接敲除的方法并不實用。所以，研究者多使用反義寡核苷酸抑制劑來阻斷小RNA的作用[15-17]。這種抑制劑是體外化學合成，能與特異性小RNA完全互補的反義RNA。在借助轉(zhuǎn)染試劑進入目的細胞后，能快速并穩(wěn)定地與內(nèi)源性成熟小RNA分子互補結合，從而阻止了內(nèi)源性小RNA分子與靶基因配對。

3.2 小RNA的過表達

與常規(guī)mRNA的功能研究相似，小RNA的過表達研究也是研究小RNA功能的一種主要方式?？梢酝ㄟ^構建小RNA表達載體，或體外直接合成小RNA前體，轉(zhuǎn)入目的細胞兩種方式來實現(xiàn)。前者由于可獲得穩(wěn)定的過表達細胞株而應用較為普遍。在前一種方式中，通常先從基因組中擴增小RNA基因及其旁側(cè)序列，然后將其克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體，最后感染目的細胞觀察功能效應[18,19]

3.3 小RNA的報告基因系統(tǒng)

小RNA的報告基因系統(tǒng)，是小RNA研究中一種常用的輔助手段，它常被用于檢測單個小RNA的抑制情況及驗證小RNA的靶基因。當使用序列特異的抑制劑抑制細胞內(nèi)的特異小RNA時，常同時轉(zhuǎn)入3′UTR區(qū)含有該小RNA互補序列的報告基因載體，來驗證小RNA的作用是否被阻斷[20]。同樣，為了驗證預測的靶基因是否被小RNA所抑制，可將預測靶基因的小RNA互補位點或3′UTR序列克隆入報告基因序列的下游，然后通過分析報告基因的表達情況，來驗證靶基因預測的正確與否[21,22]。

4 前景和展望

自從第一個miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，此類非編碼小RNA成為研究的熱點。短短幾年，miRNA的研究從發(fā)現(xiàn)、認識miRNA分子到了解其功能和作用機制。近年來對miRNA的研究已經(jīng)取得了突破性進展，并且有大量的miRNA被鑒定，許多實驗室都開發(fā)了miRNA基因鑒定，靶標鑒定計算機鑒定方法。miRNA微芯片技術可以作為實現(xiàn)高通量檢測的手段，但必須有大量的已知miRNA作為基礎。生物信息學分析技術是高通量研究miRNA的有效手段，但是結果具有不確定性，需要常規(guī)分子生物學方法做輔助驗證。在實際研究中將常規(guī)分子生物學方法和生物信息學分析技術聯(lián)合使用，發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢。為預測更多miRNA，并鑒定其靶標，確定其功能，需要我們把生物信息學、分子生物學、生物化學以及遺傳學等學科的研究方法結合起來。

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（2012–09–05）

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1007-1733(2012)12-0084-03