史競(jìng)艷,羅辛茹,2,鮑江鴻,趙子德,黃丹,向乾坤

(1.武漢生物工程學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系,湖北 武漢 430415;2.湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖北 武漢 430062)

超氧化物歧化酶(SOD)是一種以超氧陰離子O2·-為底物的金屬酶,能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng),是機(jī)體內(nèi)O2·-的天然消除劑,對(duì)機(jī)體細(xì)胞起保護(hù)作用,在防御O2·-的毒性、抗衰老[1]以及預(yù)防腫瘤和抗炎[2-3]等方面起著重要的生理作用.自1969年McCord和Fridovich[4]首次從牛紅細(xì)胞中分離出超氧化物歧化酶以來,陸續(xù)在各種不同的生物組織都分離純化出SOD,并對(duì)SOD的物理、化學(xué)、藥理、臨床和作用機(jī)理等方面進(jìn)行了廣泛研究,建立了多種活力測(cè)定方法[5].其中采用較多的是鄰苯三酚法,這種方法具有操作簡單、快速、試劑便宜且用量小、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),但文獻(xiàn)報(bào)道的鄰苯三酚法測(cè)定超氧化物歧化酶活性的測(cè)定條件各不相同,而且研究的影響因素不夠全面,這就造成了測(cè)定結(jié)果的混亂和缺乏可比性,為此我們對(duì)鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行詳細(xì)研究,探討測(cè)活體系中緩沖溶液的pH值、溫度、所含EDTA的濃度、鄰苯三酚的濃度以及SOD酶濃度等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,找出鄰苯三酚測(cè)定超氧化物歧化酶活性的最優(yōu)條件,其結(jié)果可對(duì)實(shí)際工作起到一定的指導(dǎo)作用,也可為進(jìn)一步的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器試劑:牛血SOD(98%,活力為3 000 U),三羥甲基氨基甲烷(Tris,99.9%),鹽酸(開封東大化工有限公司),乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2,99.0%,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司),鄰苯三酚(貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司),均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?水為二次蒸餾水.

儀器:SP-1920UV系列雙光束紫外-可見分光光度計(jì),pHS-3E型數(shù)字酸度計(jì),電子天平(BSA124S),恒溫水槽(SYP-Ⅱ).

溶液的配制如下.(1)0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.20含2.0 mmol·L-1EDTA)溶液:準(zhǔn)確稱取12.114 g三羥甲基氨基甲烷和0.744 5 g乙二胺四乙酸二鈉,溶于水中,用稀鹽酸調(diào)pH值至8.20,定容至1 000 mL;(2) 0.01 mol·L-1HCl:準(zhǔn)確移取10 mL 1 mol·L-1的HCl溶液稀釋至1 000 mL;(3)6 mmol·L-1鄰苯三酚溶液:準(zhǔn)確稱取0.189 2 g鄰苯三酚,用0.01 mol·L-1HCl溶解,并定容于250 mL棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱中保存,使用時(shí)可稀釋;(4) 4 μg·mL-1SOD溶液:用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確移取100 μL,1 mg·mL-1SOD原液于25 mL容量瓶中定容.所有溶液的配制均采用二次蒸餾水.

1.2實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶是一種能催化超氧陰離子(O2·-)發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2的金屬酶,反應(yīng)如下:2O2·-+ 2H+→O2+ H2O2.

在堿性條件下,鄰苯三酚可在羥基H+發(fā)生離解時(shí)與溶液中的溶解氧發(fā)生反應(yīng)生成半醌自由基,并產(chǎn)生O2-;然后半醌自由基可進(jìn)一步被O2·-氧化成具有強(qiáng)吸收的醌,如下式所示:

如果溶液中含有SOD,則O2·-一經(jīng)產(chǎn)生即被SOD歧化生成H2O2和O2,半醌自由基不能形成具有強(qiáng)吸收的醌,檢測(cè)到的吸收強(qiáng)度將比無SOD時(shí)減弱,且減弱的程度與SOD的濃度或活性有關(guān),依據(jù)此原理可對(duì)SOD的活性進(jìn)行測(cè)定.

1.3實(shí)驗(yàn)方法鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定:按照表1所示的加樣量加入試管中,于25 ℃恒溫水浴槽中恒溫20 min后,準(zhǔn)確移取0.30 mL 的2.5 mmol·L-1鄰苯三酚(對(duì)照管用0.01 mol·L-1HCl代替),立即混勻,迅速倒入比色池中,在波長為320 nm下采用紫外-可見分光計(jì)對(duì)鄰苯三酚自氧化中間產(chǎn)物進(jìn)行時(shí)間掃描,掃描間隔為1 s,掃描5 min,記錄該掃描曲線斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率ΔA0,每次測(cè)定重復(fù)2～3次,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性.

SOD活性的測(cè)定:SOD活性測(cè)定法按上述操作,加入鄰苯三酚前,先加入一定量SOD,并減少同體積二次蒸餾水,其他操作均與上述相同,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次,記錄該曲線的斜率即為ΔASOD.鄰苯三酚自氧化的抑制率定義為:抑制率=(ΔA0-ΔASOD)/ΔA0×100%.

表1 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定加樣表

2 結(jié)果與討論

圖1 鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在不同時(shí)間掃描的吸收光譜

2.1鄰苯三酚自氧化中最大吸收波長的選擇鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在特定波長處有靈敏吸收峰,但在具體應(yīng)用中,測(cè)定波長的選擇存在較大差異,主要有420 nm[6]和325 nm[7].為了準(zhǔn)確測(cè)定其最大吸收峰位置,對(duì)鄰苯三酚自氧化過程在不同時(shí)間進(jìn)行光譜掃描,掃描波長范圍為200 ～700 nm,其結(jié)果見圖1.由圖可看出,在反應(yīng)一開始時(shí)即在320 nm處出現(xiàn)了最大吸收峰,420 nm處基本無吸收峰出現(xiàn).隨自氧化反應(yīng)的不斷進(jìn)行,反應(yīng)中間產(chǎn)物不斷積累,320 nm處峰的吸收強(qiáng)度不斷增加,在30 min時(shí)峰強(qiáng)度有所降低,主要是由于自氧化進(jìn)程在30 min時(shí)反應(yīng)已基本完成.而420 nm處直到10 min時(shí)才觀測(cè)到有峰出現(xiàn),并且最大吸收峰的位置更準(zhǔn)確地說應(yīng)為440 nm處.文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收峰為420 nm和325 nm并不準(zhǔn)確.考慮到峰的靈敏性和準(zhǔn)確性問題,本實(shí)驗(yàn)均選擇在波長為320 nm處進(jìn)行測(cè)定.

圖2 鄰苯三酚自氧化進(jìn)程吸光度隨時(shí)間變化關(guān)系

2.2鄰苯三酚自氧化速率進(jìn)程按照表1的加入量,在波長為320 nm下,對(duì)鄰苯三酚自氧化過程進(jìn)行時(shí)間掃描,結(jié)果如圖2所示,在反應(yīng)初期,吸光度隨時(shí)間變化呈線性,且線性關(guān)系維持至約5 min,此后斜率漸變平緩,期間反應(yīng)液由無色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色.為了準(zhǔn)確表示反應(yīng)初期鄰苯三酚的自氧化速率,我們每次實(shí)驗(yàn)均選取了從30～210 s即3 min時(shí)間段內(nèi)直線斜率來表示鄰苯三酚的自氧化速率ΔA0.

圖3 鄰苯三酚濃度對(duì)其自氧化速率的影響

2.3鄰苯三酚自氧化最佳濃度的確定鄰苯三酚濃度可對(duì)其自氧化產(chǎn)物的濃度產(chǎn)生影響,從而影響吸收信號(hào)的強(qiáng)度,因此,固定其他條件不變,僅改變鄰苯三酚的濃度,測(cè)定其對(duì)自氧化速率的影響,結(jié)果如圖3所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著鄰苯三酚濃度的增大,自氧化速率也隨著增大,兩者呈線性關(guān)系,線性方程為ΔA/min-1=0.006 13+0.027 19c/mmol·L-1(R=0.999 09).結(jié)果說明鄰苯三酚自氧化具有一級(jí)反應(yīng)特征.由圖可知,在鄰苯三酚濃度為2.5 mmol·L-1時(shí),鄰苯三酚自氧化的曲線斜率約為0.06～0.07,基本滿足文獻(xiàn)[8]要求,因此在后面實(shí)驗(yàn)中均選用鄰苯三酚的濃度為2.5 mmol·L-1.

圖4 SOD的不同加入量對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響

2.4超氧化物歧化酶的最佳加入量的選擇為了解SOD對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響,固定鄰苯三酚的濃度為2.5 mmol·L-1不變,改變SOD的加入量,測(cè)定SOD的加入量對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,由圖可知,鄰苯三酚自氧化速率與酶的加入量成反比,這與鄰苯三酚法測(cè)定超氧化物歧化酶的機(jī)理[9]是一致的.在堿性條件下,鄰苯三酚可在羥基H+發(fā)生離解時(shí)與溶液中的溶解氧發(fā)生反應(yīng)生成半醌自由基,并產(chǎn)生O2·-;然后半醌自由基可進(jìn)一步被O2·-氧化成具有強(qiáng)吸收的醌,該醌在320 nm處有強(qiáng)吸收,但如果溶液中含有SOD,則O2·-一經(jīng)產(chǎn)生即被SOD歧化生成H2O2和O2,半醌自由基不能形成具有強(qiáng)吸收的醌,因此檢測(cè)到的吸收強(qiáng)度將比無SOD時(shí)減弱,且減弱的程度與SOD的濃度或活性有關(guān),SOD酶活就是通過對(duì)鄰苯三酚的抑制程度來測(cè)定的.因此,酶加入的越多,對(duì)鄰苯三酚的抑制就越強(qiáng),自氧化速率就越小.但文獻(xiàn)[10]報(bào)道,最優(yōu)的加酶量應(yīng)為能抑制鄰苯三酚的自氧化下降約50%為宜,此時(shí)測(cè)定的準(zhǔn)確度和靈敏度都會(huì)比較高,據(jù)此本實(shí)驗(yàn)最終確定酶的加入量0.30 mL.

圖5 EDTA對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響

2.5EDTA含量對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響在鄰苯三酚經(jīng)典自氧化方法中文獻(xiàn)報(bào)道的緩沖溶液介質(zhì)組成較混亂,有的在緩沖液中加入EDTA,但也有不加的.為了考察EDTA在鄰苯三酚自氧化過程中的作用,我們配制了一系列EDTA濃度分別為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液,研究其對(duì)鄰苯三酚自氧化的影響,結(jié)果如圖5所示.由圖5可知,EDTA加入后對(duì)鄰苯三酚的自氧化進(jìn)程有明顯的影響,并隨著EDTA加入量的增加,鄰苯三酚的自氧化速率不斷降低,在EDTA的濃度小于3 mmol·L-1時(shí),EDTA對(duì)鄰苯三酚的影響比較明顯,而當(dāng)EDTA的濃度大于3 mmol·L-1以后,對(duì)鄰苯三酚的自氧化速率影響較小.據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道,大多數(shù)金屬離子對(duì)鄰苯三酚自氧化速率有促進(jìn)作用,盡管實(shí)驗(yàn)中所用水為二次去離子水,但水中仍然不可避免還會(huì)有少量的金屬離子存在,當(dāng)EDTA加入后,由于EDTA較強(qiáng)的配位能力,導(dǎo)致溶液中的金屬離子由于被絡(luò)合而失去對(duì)鄰苯三酚自氧化的促進(jìn)作用,加入的EDTA越多,被絡(luò)合的金屬離子越多,自氧化速率就越慢,而當(dāng)溶液中所有的的金屬離子都被絡(luò)合后,再增加EDTA,因?yàn)闆]有了游離金屬離子的存在,因此自氧化的速率便維持恒定不變.考慮到SOD酶為Cu,Zn-SOD,本身就含有金屬離子,如果加入EDTA太多,有可能也會(huì)和SOD的金屬離子絡(luò)合,從而導(dǎo)致酶的失活,而加入EDTA太少,會(huì)使鄰苯三酚自氧化速率過高，導(dǎo)致自氧化反應(yīng)速率不穩(wěn)定.綜上分析,最終確定EDTA的加入濃度為2 mmol·L-1.

圖6 不同pH值對(duì)鄰苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影響(-自氧化速率,-抑制率)

2.6pH值對(duì)鄰苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影響鄰苯三酚在堿性條件下可發(fā)生自氧化反應(yīng),由此可知溶液的pH值在鄰苯三酚自氧化中起著重要作用,控制測(cè)定體系其他條件不變,僅改變緩沖溶液的pH值進(jìn)行實(shí)驗(yàn).pH對(duì)鄰苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影響如圖6所示,結(jié)果表明,鄰苯三酚自氧化速率隨pH的升高而增大,這可能與pH值增大時(shí)鄰苯三酚的酚羥基中H+更易離解,形成的帶電基團(tuán)能量較高、不穩(wěn)定,而易被氧化有關(guān)[11].從圖中也可看出,SOD抑制率隨pH增加總體呈下降趨勢(shì),其中在pH值為8.00～8.40時(shí),SOD抑制率受pH值變化的影響不明顯,即在此范圍內(nèi)pH值的微小變化并不會(huì)引起抑制率的明顯改變.在選擇最適宜pH時(shí),要考慮兩方面的因素:一是要有較高的自氧化速率;二是要有明顯的抑制率,文獻(xiàn)[8]報(bào)道多采用加酶后抑制率為50%作為最適條件.因此,綜合考慮諸因素的影響,本文中選擇pH 8.20作為緩沖溶液適宜的pH值.

圖7 不同溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影響(-自氧化速率,-抑制率)

2.7溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影響為了考察溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影響,固定其他條件不變,分別在15、20、25、30、35 ℃的反應(yīng)溫度下測(cè)定溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影響,結(jié)果如圖7所示.

由圖7可看出,溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率和SOD抑制率總體來說影響較小,在溫度從15～35 ℃范圍內(nèi),自氧化速率變化范圍0.052～0.058,而抑制率的變化范圍11%～16%.從圖7也可以看出,隨溫度升高,抑制率總體呈上升趨勢(shì),但考慮到在較高溫度下,自由基不穩(wěn)定,衰減速率加快,使測(cè)定的靈敏度和穩(wěn)定性大大降低,因此本研究均采用在室溫(25 ℃)下進(jìn)行.

3 結(jié)論

本文中采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶的活性,該法具有操作簡便、快速、試劑便宜且用量小,重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn);通過對(duì)鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行詳細(xì)研究,獲得了測(cè)定SOD活性的最優(yōu)條件為:實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃,0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH值為8.20且含2.0 mmol·L-1EDTA),鄰苯三酚濃度為2.5 mmol·L-1,控制酶的加入量為0.30 mL.

[1] Huang J Z, Lemire B D.Mutations in the C1 elegans succinate dehydrogenase ironsulfur subunit promote superoxide generation and prematureaging[J].Mol Biol,2009,387:559-569.

[2] Monari M,Trinchero A.Calabrese C1 superoxide dismutase in gastric adenocarcinoma:is it a clinical biomarker in the development of cancer[J].Biomarkers,2006,11(6):574-584.

[3] Weydert C J, Waugh T A, Ritchie J M.Overexpression of manganese or copperzinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growth[J].Free Radic Biol Med, 2006, 41(2):226-237.

[4] McCord J M, Fridovich I.Superoxide dismutase anenzymic function forerythrocup rein[J].J Biol Chem, 1969,244:6049-6055.

[5] 鄒國林.對(duì)SOD研究中若干問題的看法[J].中國生化藥物雜志,1995,16 (4):186-189.

[6] 張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,1997:217.

[7] 鄧碧玉,袁勤生,李文杰.改良的鄰苯三酚自氧化測(cè)定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展,1991,18(2):163.

[8] 張宏,譚竹鈞.四種鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性方法的比較[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2002,33(6):677-681.

[9] 楊磊,陳冠華,崔建超,等.熒光動(dòng)力學(xué)法測(cè)定超氧化物歧化酶的活性[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2008,36(4):489-493.

[10] 許申鴻,杭瑚,李遠(yuǎn)平.超氧化物歧化酶鄰苯三酚測(cè)活法的研究及改進(jìn)[J].化學(xué)通報(bào),2001(8):516-519.

[11] 袁倬斌,高若梅.鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),1997, 18(9):1438-1441.