蟲紋鱈鱸線粒體COI基因片段的克隆與序列分析

對蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和測序，并對COI序列進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，澳洲蟲紋鱈鱸COI基因序列長度為652bp，A、C、T、G 4種堿基平均比例分別為25.3%、16.6%、32.9%、25.2%，A+T比例 (58.2%)明顯高于G+C (41.8%)。與從GenBank中查到的其他6種真鱸科魚類的同源序列比對，并采用最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示：7種真鱸科魚類聚在一起，分為2個(gè)大的支系，麥鱈鱸屬魚類聚為一支，麥?zhǔn)削|屬、鱖屬和花鱸屬的魚類聚為一支。其中，花鱸屬的花鱸與鱖屬魚類親緣關(guān)系較近，與其他兩屬關(guān)系稍遠(yuǎn)。所得的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類基本一致。

蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)；COI基因；克隆；序列分析

蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)鱸形目(Perciformes)真鱸科(Percichthyidae)麥鱈鱸屬(Maccullochella)，原產(chǎn)于澳大利亞東南部墨瑞達(dá)令河流域。此魚為世界上最大淡水魚之一，生長速度快、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)。不僅適合水產(chǎn)養(yǎng)殖，亦可做觀賞魚。目前國內(nèi)雖有幾家單位引進(jìn)了蟲紋鱈鱸，但有關(guān)研究尚少，主要集中在其生物學(xué)特性及馴化養(yǎng)殖等方面[1-4]，對其線粒體DNA(mtDNA)的研究尚未見報(bào)道。

COI基因是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，進(jìn)化速度快，包含的遺傳進(jìn)化信息量大，在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域應(yīng)用較廣[5-7]。本研究對引進(jìn)蟲紋鱈鱸mtDNA COI基因序列片段進(jìn)行了擴(kuò)增和測序，并對其序列特征進(jìn)行了分析，結(jié)合GenBank中已報(bào)道的其他6種真鱸科魚類COI基因的同源序列進(jìn)行了比較，以期為蟲紋鱈鱸的種質(zhì)資源和遺傳育種研究提供背景資料，并為真鱸科魚類分類和系統(tǒng)進(jìn)化提供分子生物學(xué)上的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蟲紋鱈鱸樣本取自山東濟(jì)南羅非魚國家級良種場東溫室水泥池，由山東省淡水水產(chǎn)研究所從澳大利亞引進(jìn)。每個(gè)個(gè)體取新鮮肌肉，于-70℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2 總DNA的提取與檢測

取100mg樣品低溫下剪碎并研磨為糊狀，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，保存于-20℃冰箱用于PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增

采用已報(bào)道的一對通用引物擴(kuò)增蟲紋鱈鱸COI基因。引物序列分別為：COIa：5’-AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC-3’和COIf：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3’[8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TaKaRa公司的TP650型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體積為50μl，反應(yīng)體系為：10×buffer 5μl，25mmol/L的MgCl24μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，引物(各10μmol/L)為2μl，DNA模板2μl，Taq酶(TaKaRa，5U/μl)0.4μl，由滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94℃1min，56℃1min，72℃1min)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，凝膠成相系統(tǒng)觀察、照相。

1.4 PCR產(chǎn)物純化與目的片段的克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的條帶，用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，取目的片段與pMD-18T-Vector(TaKaRa)重組，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)菌，通過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，挑選白色單菌落接種于含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，挑選3個(gè)經(jīng)PCR檢測合格的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 序列分析

測得序列通過Clustal X(Version1.83)軟件進(jìn)行多序列比對和分析[9]，采用MEGA5.0[10]軟件分析序列的堿基組成和變異位點(diǎn)。從GenBank中搜索到真鱸科其他6種魚類：艾氏麥鱈鱸(Maccullochellaikei)、圓尾麥?zhǔn)削|(Macquariaambigua)、叉尾麥?zhǔn)削|(Macquariacolonorum)、鱖魚(Sinipercachuatsi)、斑鱖(Sinipercascherzeri)和花鱸(Lateolabraxjaponicus)的COI基因片段序列，采用采用最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信度由自引導(dǎo)值(Bootstrap value)估計(jì)，重復(fù)次數(shù)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及膠回收純化結(jié)果

蟲紋鱈鱸線粒體COI基因經(jīng)通用引物特異擴(kuò)增，所有樣品均擴(kuò)增出700bp左右的一條整齊而清晰的條帶，未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，對照組未檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖 1)，可以排除外源DNA 污染及核DNA 拷貝的可能性。PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，得到了純度較高的COI基因片段，電泳結(jié)果如圖2所示。

C:對照；M:Marker(DL2000)；1～5：樣品

M:Marker(DL2000)；1～5：樣品

2.2 陽性克隆檢測結(jié)果

挑取的菌斑經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖上電泳，結(jié)果如圖3所示，瓊脂糖電泳檢測的5個(gè)樣品都擴(kuò)增成功，且對照組的產(chǎn)物要比試驗(yàn)組產(chǎn)物的片段小300bp左右，說明目的片段已經(jīng)連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，陽性克隆比例比較高。

1～5：對照組(COIF和COIR引物)；1’～5’：試驗(yàn)組(M13F和M13R引物)；M：DL2000

2.3 COI基因片段的序列特征

將所測澳洲蟲紋鱈鱸的mtDNA COI基因片段在除去引物及部分端部序列后，經(jīng)比對，獲得澳洲蟲紋鱈鱸線粒體COI基因序列5’端的長度為652bp(圖4)。A、C、T、G 4種堿基在3個(gè)個(gè)體中的平均比例為25.3%、16.6%、32.9%、25.2% ，A+T 比例(58.2%)高于G+C (41.8%)。所測序的3個(gè)樣本中僅有1處堿基變異，位于220bp處，堿基A轉(zhuǎn)換成了G。

圖4 蟲紋鱈鱸COI基因片段核苷酸序列

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

為比較澳洲蟲紋鱈鱸和已報(bào)道的真鱸科其他魚類線粒體DNA COI基因的序列差異，從GenBank中下載了6種其他真鱸科4屬魚類的COI序列進(jìn)行比對，獲得隸屬于真鱸科4屬共7種魚類527bp的同源序列(含插入/缺失位點(diǎn))。其他6種真鱸科魚類的COI基因序列的長度及其登錄號詳見表1。

表1 幾種真鱸科魚類COI基因序列的長度及其登錄號

注：枝上顯示bootstrap 1000個(gè)循環(huán)的置信度

采用最大簡約法(MP)構(gòu)建了真鱸科科7個(gè)種的系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值(Bootstrap value)表示，各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50的支持率。由系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖5)可知，7種魚類聚成2個(gè)大的分支：鱖屬2種魚類首先聚在一起與花鱸屬的花鱸聚為一個(gè)亞群，然后再與麥?zhǔn)削|屬2種魚類聚為一支；而蟲紋鱈鱸3個(gè)個(gè)體先聚在一起，然后再與同屬于麥鱈鱸屬的艾氏麥鱈鱸聚成一支，表現(xiàn)為與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致，說明mtCOI基因適合于物種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化的研究。

3 討論

線粒體DNA是共價(jià)閉合的雙鏈分子，其結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、幾乎不發(fā)生重組、呈嚴(yán)格的母系遺傳，已成為一種應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記[11]。線粒體DNA不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異，適合不同水平的進(jìn)化研究[12]，COI基因該基因近年來在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面有較多的研究[13-16]。

本研究對澳洲蟲紋鱈鱸線粒體DNA COI基因部分片段序列進(jìn)行了PCR特異性擴(kuò)增，得到652bp的堿基序列，其中A、C、T、G 4種堿基在3個(gè)個(gè)體中的平均比例為25.3%、16.6%、32.9%、25.2%。堿基T含量最高，C的含量最低，A+T (58.2%) 含量明顯高于G+C (41.8%)，符合脊椎動(dòng)物 mtDNA COI堿基組成的特點(diǎn)[17]。通過對澳洲蟲紋鱈鱸COI基因片段遺傳特征的研究，發(fā)現(xiàn)其在種內(nèi)的變異比較低，所測3個(gè)樣本堿基序列基本一致，僅有1處變異。在mtDNA的基因序列中，由于受到的選擇壓力不同導(dǎo)致各個(gè)區(qū)域進(jìn)化速率不同[18]。張巖等[19]對2種黃蓋鰈線粒體DNA3個(gè)蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育信息研究指出核苷酸替代速率最快的是D-loop，COI和Cyt b核苷酸替代速率基本一致。Zardoya等[20]研究了脊椎動(dòng)物的13個(gè)蛋白編碼基因所包含的系統(tǒng)發(fā)育信息情況指出，ND4、ND5、Cyt b和COI含有良好的系統(tǒng)發(fā)育信息。彭士明等[21]采用線粒體D-loop區(qū)與COI基因序列比較分析了養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性，基于D-loop序列的分子方差(AMOVA)分析顯示養(yǎng)殖與野生銀鯧群體間具有較高的遺傳分化，而基于COI基因片段AMOVA分析顯示兩群體間并無明顯的遺傳分化，說明線粒體D-loop區(qū)作為反映銀鯧群體間遺傳多樣的敏感度要高于COI基因。本研究中所測3個(gè)蟲紋鱈鱸COI基因序列基本一致也同時(shí)驗(yàn)證了COI基因比較保守這一事實(shí)，COI基因可能更適用于種間及種以上階元的分析。要進(jìn)一步了解蟲紋鱈鱸的群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性等還需借助其他方法，如對進(jìn)化速率更快的D-loop區(qū)進(jìn)行測序分析，或者采用SSR或者AFLP法掃描信息量更大的核DNA。

同時(shí)，與從GenBank中查到的其他6種真鱸科魚類的同源序列比對，并采用最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示7種真鱸科魚類聚在一起，分為2個(gè)大的支系，鱈鱸屬的2種魚類聚為一支；麥?zhǔn)削|屬、鱖屬以及花鱸屬的魚類聚為一支。由聚類結(jié)果可知，花鱸屬的花鱸與鱖屬魚類親緣關(guān)系較近，與其他兩屬魚類親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，表現(xiàn)為與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。

澳洲蟲紋鱈鱸具有生長速度快、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，養(yǎng)殖前景十分看好。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究澳洲蟲紋鱈鱸的遺傳變異、種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化打下了基礎(chǔ)，但要了解其更多的遺傳背景，尚需借助其他分子生物學(xué)手段和資料。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.08.009

Q785；Q959.483

A

1673-1409(2012)08-S025-05

2012-08-01

農(nóng)業(yè)部“948”計(jì)劃項(xiàng)目(2011-z41)。

張龍崗(1982-)，男，山東濟(jì)寧人，碩士，助理研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。

朱永安， E-mail：zhuyongan1965@163.com。