李元宏 常冰梅

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西汾陽(yáng) 032200

RNA干擾survivin基因?qū)m頸癌細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)及caspase-3酶活性的影響

李元宏1，2常冰梅1

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西汾陽(yáng) 032200

目的 觀察RNA干擾survivin基因?qū)m頸癌細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)及caspase-3酶活性的影響。 方法 針對(duì)survivin mRNA序列設(shè)計(jì)合成3對(duì)編碼小干擾RNA（siRNA）的DNA模板，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)染效率最高的陽(yáng)性克隆，陰性對(duì)照為陽(yáng)性克隆隨機(jī)打亂序列。Western blot方法檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)，分光光度法檢測(cè)caspase-3酶活性。 結(jié)果 干擾48 h時(shí)，siRNA-168載體干預(yù)組干預(yù)效果最好，siRNA陽(yáng)性質(zhì)粒干擾組（實(shí)驗(yàn)組）survivin蛋白表達(dá)量為陰性對(duì)照組中survivin蛋白表達(dá)量的13%，是空白組survivin蛋白表達(dá)量的16%。干擾后caspase-3活性表達(dá)升高，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 siRNA可有效抑制Hela細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)，升高caspase-3酶活性。

survivin基因；宮頸癌細(xì)胞；survivin蛋白；caspase-3

宮頸癌是女性近年來(lái)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是由人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）引起，在全世界，發(fā)展中國(guó)家宮頸癌發(fā)病率較高，我國(guó)每年新增病例13萬(wàn)以上[1]，每年有20多萬(wàn)名女性死于該病。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，表達(dá)于腫瘤組織[2]。RNA干擾是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶會(huì)降解靶RNA[3]，該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的常用技術(shù)。本研究擬采用RNA干擾技術(shù)[4]，針對(duì)人survivin基因mRNA序列構(gòu)建3個(gè)siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的變化及細(xì)胞內(nèi)caspase-3酶活性的變化，進(jìn)而了解細(xì)胞凋亡變化，為宮頸癌的預(yù)防、檢測(cè)、治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株 siRNA重組質(zhì)粒及陰性對(duì)照由上海瑞賽生物技術(shù)公司構(gòu)建，人宮頸癌Hela細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（美國(guó)Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），Opti-MEMRⅠ培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），survivin及GAPDH一抗、二抗（愛(ài)博生公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃閷?shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白組。實(shí)驗(yàn)組采用構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組采用隨機(jī)打亂的陽(yáng)性質(zhì)粒序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染；空白組無(wú)干擾。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行，調(diào)整細(xì)胞密度為 4×106～5×106/mL，轉(zhuǎn)染前 1 d，將細(xì)胞懸液接種至6孔板。以250 μL Opti-MEMⅠ稀釋5 μL LipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育 5 min。以 250 μL Opti-MEMⅠ稀釋7.5 μL siRNA，輕輕混勻，孵育5 min后，將稀釋的siRNA和稀釋的LipofectamineTM2000輕輕混合，在室溫下孵育20 min，以便允許復(fù)合物的形成。將siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖動(dòng)混合，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，進(jìn)行熒光檢測(cè)。分別取5個(gè)視野觀察干擾效果，取平均值，公式計(jì)算干擾率（%）=（陰性對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/陰性對(duì)照組。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)量 6孔板中每孔加入1 mL總蛋白提取液，充分吹打，在冰上放置10～20 min后，再吹打5～20 min，將勻漿液吸出置于 1.5 mL離心管中，超聲 3 次，每次 3 s，9 000 r/min，離心 5 min，取適量上清置于新的1.5 mL離心管中。取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS封閉1 h。加入一抗，37℃孵育l h，加入二抗，室溫孵育45 min，化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.2.4 caspase-3活性檢測(cè) 采用分光光度法利用caspase-3活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行caspase-3活性檢測(cè)。首先制作pNA濃度/A405吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，然后在被檢測(cè)標(biāo)本中加入底物Ac-DEVD-pNA 2 mmol/L后混勻，37℃孵育60～120 min，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405。樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405，即為樣品中caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=98.6946X-23.9127（Y為pNA濃度，X為A405吸光度值）求出各樣本pNA濃度。Braford法測(cè)定樣本蛋白濃度，caspase-3活性=Y/蛋白濃度，計(jì)算出caspase-3酶活力大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾效果觀察

光鏡下觀察干擾48 h效果可見(jiàn)，陽(yáng)性質(zhì)粒干擾后，成功干擾細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)70%以上，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.2 三組survivin蛋白表達(dá)量比較

轉(zhuǎn)染48 h后，用灰度掃描軟件測(cè)量Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組survivin蛋白表達(dá)量為陰性對(duì)照組survivin蛋白表達(dá)量的13%，是空白組survivin蛋白表達(dá)量的16%。見(jiàn)圖 2、3。

2.3 三組caspase-3活性檢測(cè)情況

各組酶活力單位檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組為（1.32±0.10），陰性對(duì)照組為（1.61±0.20），實(shí)驗(yàn)組為（3.40±0.26），實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即siRNA干擾組顯著升高了caspase-3酶活性。

3 討論

survivin基因是一個(gè)抗凋亡基因，因?yàn)槠湟种频蛲鲇欣谀[瘤細(xì)胞存活而得名為“存活素”，其組織學(xué)分布具有特異性，且具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡能力和特殊的作用途徑及位點(diǎn)[5]。研究表明，survivin基因決定簇缺失的突變體能誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)性凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)，使其逐漸成為腫瘤病因及治療研究熱點(diǎn)。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因緘默，它能觸發(fā)某種轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序，導(dǎo)致特定mRNA單鏈的降解。survivin蛋白在參與細(xì)胞凋亡過(guò)程中有兩條途徑：外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑又稱(chēng)為死亡受體通路，是由胞外腫瘤壞死因子（TNF）超家族的死亡配體引發(fā)。內(nèi)源性凋亡途徑又稱(chēng)為線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的通路[6]。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，釋放出的的細(xì)胞色素C在dATP存在下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9進(jìn)一步激活其他的caspase，如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。survivin蛋白還可直接作用于caspase，主要抑制caspase-3和caspase-7的活性，同時(shí)，survivin也可通過(guò)P21間接抑制caspase。目前凋亡過(guò)程的詳細(xì)機(jī)制還不完全清楚[8]，但是caspase在凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，細(xì)胞凋亡的過(guò)程實(shí)際上是caspase不可逆的水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少14種caspase。caspase活化有兩種機(jī)制，即同源活化和異源活化。被異源活化的caspase又稱(chēng)為執(zhí)行caspase，包括 caspase-3、caspase-6 和 caspase-7。

筆者應(yīng)用RNAi技術(shù)將survivin siRNA轉(zhuǎn)染survivin高表達(dá)的宮頸癌Hela細(xì)胞株，使survivin基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，survivin蛋白表達(dá)也相應(yīng)下降，caspase-3的酶活性增加，細(xì)胞凋亡率增加。這表明survivin siRNA能夠成功下調(diào)細(xì)胞內(nèi)survivin基因的表達(dá)，有效降低survivin對(duì)caspase的抑制作用，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞和分子生物學(xué)的改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。這些現(xiàn)象提示我們survivin過(guò)度表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是該病治療的重要靶標(biāo)，為宮頸癌的治療研究提供重要的依據(jù)。

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The effects of RNA interference survivin gene on the expression of survivin protein and caspase-3 enzyme activity in cervical cancer cells

LI Yuanhong1，2CHANG Bingmei1

1.Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030006,China;2.Fenyang College Shanxi Medical University,Shanxi Province,Fenyang 032200,China

ObjectiveTo investigate the effect of RNA survivin interference gene on the expression of survivin protein and the activity of caspase-3 enzyme in cervical cancer cells.MethodsAccording to the survivin mRNA sequence,3 pairs of DNA template for small interference RNA(siRNA)was designed and synthetized,shRNA recombination plasmid was built,Hela cells was transfected.The positive clones with the highest transfection efficiency was isolated,and negative control was the randomly upseted sequence of positive clones.Western blot method was used to detect the expression of survivin protein and spectrophotometry was used to detect the activity of caspase-3 enzyme.ResultsAt 48 h of interference,the siRNA-168 vectors intervention group had the best effect.The survivin protein expression of the siRNA positive plasmid interfern group(experimental group)was 13%of the negative control group,which was 16%of the blank control group.After interference,the activity of caspase-3 rised and there was significant difference not only between experimental group and negative control group,but also between experimental group and blank control control(P＜0.05).ConclusionsiRNA can inhibit the expression of survivin protein in Hela cells effectively and increase caspase-3 activity.

Survivin gene;Cervical cancer cell;Survivin protein;Caspase-3

R737.3

A

1673-7210（2012）08（a）-0022-03

李元宏（1974.9-），男，碩士研究生，山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院講師；研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。

常冰梅，女，博士研究生，山西醫(yī)科大學(xué)副教授。

2012-03-01 本文編輯：程 銘）